Диссертация (Физиолого-биохимические особенности АТФазной активности крови и молока у продуктивных животных с различными типами обмена веществ в постнатальном онтогенезе), страница 7

и др., 1981);тимерзол, этилмеркуриат (Болдырев А.А., 1985); холестерин (Клюева Н.Н.,Матвеева И.М., Кожевникова К.А., 1989); феноксирадикалы (Kurella E.G.,Osipov A.N., Goldman R., Boldyrev A.A., 1995); ионофорные антибиотики(Abusalah K.M., 1995). Из природных источников обращает на себя вниманиеацетилхолин.Исследователи установили, что концентрация оуабаина 10-6 М ингибируетактивность Nа+, К+ - АТФазы на 50% (Туракулов Я.Х. и др., 1969;Ташмухамедов Б.А., 1982), что связывают с вытеснением оуабаином калия изкалий чувствительной зоны фермента. В случае повышения концентрации Nа+происходит еще большее снижение АТФазной активности в присутствииингибитора в результате конкуренции ионов натрия и калия.Связывание одной молекулы оуабаина с одной молекулой Nа+, К+ АТФазы приводит к полному ингибированию активности фермента (БолдыревА.А., 1985).

Однако, чувствительность Nа+, К+ - АТФазы к оуабаину у разныхвидов животных неодинакова. Наиболее чувствителен к оуабаину фермент,полученный из тканей человека, быка, собаки, ягнят; наименее - Nа+, К+ АТФаза, выделенная из почек и сердца кролика, морской свинки и крыс(Вишняков С.И., 1988). По всей видимости, эти различия обусловлены белковымсоставом мембран (Болдырев А.А., 1985), а также существованием резистентной35к влиянию оуабаина ионообменной стадии действия АТФазы (Lev A.A., PisarevaL.N.,1970).В одних случаях для полного ингибирования Nа+, К+ - АТФазы достаточнаконцентрация оуабаина 10-4 М, а в других – 10-3 М и выше (Болдырев А.А.,1977).

Оуабаин в концентрации 10-8 - 10-9 М активирует Nа+, К+ - АТФазнуюактивность полностью (Котык А., Япачек К., 1980; Вишняков С.И., 1988),поэтому активность Nа+, К+ - АТФазы рассчитывают как разность между общей(Nа+, К+, Мg²+ - АТФазой) и оуабаиннечувствительной АТФазой (Мg²+ АТФазой) (Болдырев А.А., 1977).Henning G., Cloix J. (1983), Cloix J.F. et al. (1983) выделили специфическиеингибиторы фермента из тканей и биологических жидкостей, в частности, изэритроцитов и плазмы крови человека.Батоцыреновой Е.Г.

(2005) выделен и очищен до гомогенного состояния измозга крупного рогатого скота новый ингибитор Nа+, К+ -АТФазы нервныхклеток. Идентифицирована химическая структура и изучены его свойства.Выделенное соединение, тройное к Nа+, К+ -АТФазе, является представителемнового класса ингибиторов этого фермента.

Данный ингибитор, отличающийсяпостроениюотэндогенногооуабаина,характеризуетсяаналогичнойспецифичностью, ингибирующей активностью, действующей при концентрациидо 10"8 М, что сопоставимо с действием оуабаина. Впервые показано, чтосинтезированные И-оксидыпиридина и хинолина иихпроизводные,ингибирующие Nа+, К+ -АТФазу нервных клеток, также проявляют высокоесродство к данному ферменту (Батоцыренова Е.Г., 2005).Как показали исследования Mitchell P., Moyle J. (1970), Robinson J. (1982)АТФазная активность обусловлена соотношением АТФ и АДФ в инкубационнойсреде. Так, увеличение содержания АДФ в инкубационной среде заметноингибирует активность АТФазы митохондрий печени крыс Nа+, К+ - АТФазаболее активно гидролизует АТФ, чем ЦТФ и другие нуклеотидные макроэрги(Mitchell P., Moyle J., 1970; Robinson J., 1982).36Результаты исследования Кырова Д.Н.

(2006) показали, что гемолизатэритроцитов, полученный при соотношении упакованных эритроцитов кгемолизирующему раствору 1:4, ингибировал Nа+, К+ - АТФазу головного мозгана 40%, в то время как при соотношениях 1:9 и 1:19 не влиял на активностьисследуемогофермента.Наличиеингибирующегоэффектагемолизата,возможно, связано с отсутствием в гемолизирующем растворе хелаторов, частоприменяемых в аналогичных работах, что позволило проявиться модулирующимэффектам двухвалентных ионов, в частности ионов кальция и магния, которыевысвобождаются при гемолизе эритроцитов (Кыров Д.Н., 2006).В настоящее время накоплено достаточное количество литературныхданных, свидетельствующих о том, что активность Nа+, К+ - АТФазы зависит отвозраста и физиологического состояния животных. Установлено, что умолодняка крупного рогатого скота (Вишняков С.И., 1988) и свиней, суточныхцыплят-бройлеров (Мосягин В.В., 2011) активность этого фермента выше, чем увзрослых животных.

Исследования Рыжковой Г.Ф. (2005), проведенные накрупном рогатом скоте, позволили установить, что у телят активность Na+, K+АТФазы теней эритроцитов примерно в 1,5 раза выше, чем у коров.Platt D., Horwig P. (1980) отмечают, что с увеличением возраста донораактивность Nа+, К+ - АТФазы эритроцитов падает. С возрастом, по даннымLogan J., George M. (1982), происходит снижение Nа+, К+ - АТФазнойактивности в мозге; по данным Kjeldsen K. et al.

(1982) - в скелетной мышцекрыс. Одновременно с этим при старении эритроцитов увеличиваетсямикровязкость их мембран (Ли С.В. и др., 1982), в них снижается АТФ на 20%(Bartosz G., 1982), что отрицательно сказывается на активности фермента.Активность Nа+, К+ - АТФазы изменяется при зимней спячке животных.Nа+, К+ - АТФазная активность мозга хомячков, находившихся в зимней спячке,выше, чем у бодрствующих животных (Coldman S.S., Willis J.S., 1973).Изменение активности фермента объясняется тем, что во время зимней спячкиувеличивается«текучесть»плазматическихмембранмозгавследствие37увеличения в их составе фосфолипидов, содержащих остатки непредельныхжирных кислот (Вишняков С.И., 1988).Применение 3% пептидной кормовой добавки из дехромированныхотходов кожевенного производства, по данным Фурмана Ю.В.

(1991), повышаетАТФазные активности гомогенатов органов и тканей цыплят-бройлеров.Исследования показали, что включение в рацион коров муки термическиобработанного зерна сои в количестве 85 г на 1 кг молока стимулируетактивность транспортных АТФаз и белково-минеральный обмен.

Так, в среднемза лактацию в мембранах эритроцитов удельная активность общей (Mg2+, Na+,K+ -) АТФазы превышает этот показатель у контрольных животных на 12,1%;Mg2+ - АТФазы – на 10,0% и Na+, K+ - АТФазы – на 13,9%; в сухостойныйпериод соответственно – на 6,1; 7,2 и 5,0 % (Рыжкова Г.Ф. 2005).Работами С.И.Вишнякова (1972) обнаружена активность Na+,, K+, Mg2+ АТФазы свойственная оболочкам жировых шариков молока и варьирующая от2,66 до 4,77 мг фосфора неорганического на 1 мг % белка (72). Активность Na+,K+, Mg2+ - АТФазы молока по данным М.П.Рязанского (1973), в различныепериоды лактационно - воспроизводительной функции коров колебалась от 2,4 ±0,21 до 16,08 ± 0,92 мг фосфора неорганического на 100 мл молока за 45 минутинкубации.По данным Дежкиной И.В. (2008) уровень активности Na+,, K+-АТФазыизменяется в зависимости от половой цикличности и характера воспалительногопроцесса в миометрии коров, что связано с рядом морфологических ибиохимических изменений.

При патологии, в частности, при воспалительныхпроцессах матки активность ферментов в клетках миометрия снижалась. Так,при остром эндометрите активность Nа+-, К+- АТФазы в миометрии достигала19,9±0,3 нмоль неорганического фосфора/мг белка/мин, что было достоверно(P<0,05) меньше по сравнению с аналогичным показателем у здоровых коров(Дежкиной И.В., 2008).381.2.2 Структура, активность и биологическая роль Мg²+ -АТФазыПо своей химической природе Мg²+-АТФаза является полипептидом смолекулярной массой 103-107 кД, который локализуется в Т-трубочкахмышечных волокон скелетных мышц. Длительное время считалось, что Мg²+ АТФаза представляет собой модифицированную Са²+-АТФазу, т.к. ферментхарактеризовался высокой каталитической активностью (около 15 мкмольфосфора неорганического/мг белка в мин) в мембранных препаратах,обогащенных Т-трубочками, а также существовала близость молекулярных массСа²+-АТФазы саркоплазматического ретикулума и Мg²+ - АТФазы.Благодаря использованию современных методов разделения мембрансаркоплазматического ретикулума и Т-системы удалось доказать, что этиферменты различаются по ряду свойств и принадлежат различным мембранам.Так, Мg²+ - АТФаза – гликопротеид и в отличие от Са²+ - АТФазы она связываетконканавалинА иагглютинин, существенноактивируясь ими;имеетизоэлектрическую точку в более кислой области, иные рН и температурныйоптимум;активируетсямиллимолярнымиконцентрациямимагния;неподчиняется кинетике Михаэлиса-Ментена, проявляя свойства отрицательнойкооперативности по отношению к субстрату (Левицкий Д.О., 1990).В настоящее время высказывается предположение о том, что Мg²+-АТФазапринимает участие в передаче сигнала с поверхностной мембраны ктерминальным цистернам саркоплазматического ретикулума, регулирует выбросСа²+ в цитоплазму, обеспечивает поддержание соответствующего градиентапротонов (за счет гидролитического расщепления АТФ) по обе сторонымембраны Т-трубочки.ИсследованияуровняактивностиMg2+-зависимойАТФазытенейэритроцитов человека и крысы (Шевченко А.С., Орлов С.Н., 1977) показали, чтомаксимум активности приходится на концентрацию кальция 500,0 мкМ, приэтом повышение концентрации Ca2+ до 2,0 мМ приводило к полномуингибированию активности АТФазы.39Рыжкова Г.Ф.

(2005) в своей работе доказала, что Mg2+ - и Na+, K+АТФазы с развитием первой половиныбеременности коров, котораяприходится на 3-7-ой месяцы лактации, увеличивают свою активность в теняхэритроцитов, проявляя максимум на 4,5-5 месяце стельности, а непосредственнок родам снижают ее. Это полностью согласуется с данными Жарской С.К. (1974)иКолисникаА.В.(1980),которыеобъясняютсложившуюсякартинуперераспределением соответствующих ионов между эритроцитами и плазмойкрови, вызванного изменением гормонального фона и усилением обменавеществ у стельных коров.1.2.3 Структура, активность и биологическая роль Са2+-АТФазыИз всех одно- и двухвалентных ионов, присутствующих в клетках живыхорганизмов, природа выбрала кальций для осуществления регуляторныхфункций. Кальций является основным элементом костной ткани, участвует впроцессах свертывания крови, сокращения сердечной мышцы и скелетноймускулатуры, передачи нервного импульса, секреции гормонов и регуляцииактивности ферментов (Рыжкова Г.Ф., 2005).Ионы кальция играют важнейшую роль в обеспечении жизнедеятельностиклеток и организма в целом:-функционируют как составная часть опорных тканей или мембран,обеспечивая целостность мембран (влияет на проницаемость), т.

к. способствуетплотной упаковке мембранных белков. Ионы кальция уплотняют клеточныеоболочки, уменьшают их проницаемость - в противоположность ионам натрия икалия, увеличивающих проницаемость,- участвуют в проведении нервного импульса,- участвуют в инициации мышечного сокращения, т.к. образованиекомплекса актин+миозин (сокращение) возможно только в присутствии ионовкальциявнутримиоцита.Вмышечныхклеткахнамембранесаркоплазматического ретикулума (СПР) находится "кальциевый насос (канал)",40через который регулируется вход и выход кальция в СПР и тем самымконцентрация его внутри клетки,- являются одним из факторов гемокоагуляции,- ограничено участвуют в поддержании осмотического равновесия,- вместе с инсулином активируют проникновение глюкозы в клетки.Кальций может поглощаться клеткой пассивно, проходя через мембрануилипоградиенту концентраций, илипоэлектрическому полю, илиобмениваться на ионы натрия.