Диссертация (Физиолого-биохимические особенности АТФазной активности крови и молока у продуктивных животных с различными типами обмена веществ в постнатальном онтогенезе), страница 6

и др., 1989; Kawakami K. et al., 1986;Shull G.E. et al., 1986) обнаружено три вида ДНК, кодирующие три изоформы  субъединицы Na+, K+ - АТФазы: так называемые -,  (+)  (III)-формы. Онисостоят из 1018, 1015 и 1013 аминокислот и, соответственно, имеютмолекулярную массу около 112 кДа (Shull G.E. et al., 1986).Кроме того, появилась информация о четвертом гене, который, повидимому, также кодирует субъединицу Na+, K+-АТФазы, кроме того, выявленодва гена, кодирующих субъединицу, близкую по структуре  - субъединице Na+,K+-АТФазы (Лопина О.Д. 1999).29По данным Jaisser C.P. (1993), у различных видов животных обнаруженопять изоформ - субъединицы, входящих в состав Na+, K+-АТФазы (1, 2, 3,НК1, b1).

Их физиологическое значение для функционирования Na+-насоса,как и смысл существования нескольких её изоформ, в настоящее времянепонятны.Основной формой Na+, K+-АТФазы, встречающейся у млекопитающих,является изофермент 11-типа. Этот фермент получен в очищенном виде изпочек млекопитающих, где он преобладает (Sweander K.J.

et аl., 1985;Долапчиева С.Д. 1988; Капля А.А. и др., 1996, Blanco et al., 1998).По данным Jewell E.A. et аl. (1992), соотношение изоформ субъединицфермента зависит от типа клеток, вида и возраста животных. Так, в клетках спреобладанием 3 изоформы Na+, K+-АТФаза характеризуется более высокимсходством к Na+.В настоящее время Na+, K+-АТФаза выявлена во многих органах,особенно,значительновыделительнуюеефункциюсодержание(почки,солевыеворганах,железы)осуществляющихиливыполняющихэлектрическую работу (мозг, электрический орган) (Капля А.А., 1998; КривойИ.И. , 2003; Рыжкова Г.Ф., 2005; Кипенко А.В., 2009; Мосягин В.В., 2011)Локализация Na+, K+-АТФазы в наружных плазматических мембранах клеток,позволила считать данный фермент маркером плазматической мембраны(Болдырев А.А., 2001, Геннис Р., 1997).Na+, K+-АТФазанапрямую или косвенно регулирует такие жизненноважные процессы в клетках, как производство тепла и поддержание объемаклетки, уровня рН;управляя уровнем Са2+ имембранного потенциала,контролирует выброс и поглощение нейромедиаторов, проведение нервногоимпульса, эффективность сокращения и т.

д. (Пойнов Ю.В.,1985; Пойнов Ю.В.,Орлова С.Н., 1987; Rossier B.C., et al 1987; Болдырев А.А., 1992; Claussen, T.,1996).30Campos M. et. аl. (1992) при изучении кинетики фосфорилированияочищенного препарата Na+, K+-АТФазы выявили, что связывание АТФазы сАТФ и с Mg-АТФ характеризуется одинаковыми константами скоростей, в товремя как скорости диссоциации комплексов Е-АТФ и Е-Mg-АТФ значительноотличаются. В связи с чем, исследователями сделан вывод о том, что истиннымсубстратом для Na+, K+-АТФазы может служить не только АТФ, но и Mg-АТФ, аионы магния служат активаторами суммарного АТФазного цикла.В процессе изучения субстратной специфичности Na+, K+-АТФазысарколемы сердца Monosikova R.

et аl. (1991) установили, что наличие ОНгруппыувторогоуглеродногоатомарибозногокольцаснижаетпредпочтительность этого субстрата по сравнению с АТФ.В настоящее время активность Na+, K+-АТФазы оценивают по следующимпоказателям:- по количеству неорганического фосфора, выделяемого при гидролизеАТФ под ее воздействием;- по количеству выделяемого радиоактивного фосфора под действиемна АТФ – γ32 р;- по изменению рН среды при протекании следующих реакций:АТФ4-  АТФ3-+ Н2 РО4 -Н2 РО4-  Н+ + НРО4 2Работами ученых выявлена Nа+, К+ - АТФазная активность для некоторыхорганов и тканей различных животных.Так, в коре почек свиней активность этого фермента составила 15,6мкмоль неорганического фосфора /г белка в мин; в почках кроликов– 1,42 имозговой ткани – 1,19 мкмоль неорганического фосфора /мг белка в час; у крыс вгомогенатах слизистых оболочек тощей кишки – 9,36  0,81 и повздошнойкишки - 6,16  1,24 нмоль неорганического фосфора /мг белка в час; в ядрахпечени крыс – 5,0 мкмоль неорганического фосфора /мг белка в час; в клеткахгладких мышц сонной артерии крыс – 2,36 мкмоль неорганического фосфора /мг31клеточного белка в час; в плазматических мембранах почек собак – 38,5 - 39,2мгмоль Р неорганического фосфора /мг белка в час (Tilson M.D., 1972; ИващенкоА.Т., 1978; Голубовская С.И., Кравченко Л.С., 1979; Дъендъеши Г., 1981;Kaufman U.

et al., 1981; Anderson R.E. et al., 1982; Aviv A. et al., 1983).Активность Nа+, К+ - АТФазы мембран эритроцитов коров составляет374,4 нмоль неорганического фосфора /мг белка за 135 мин инкубации (KeetonK.S., Koneko J.J., 1972), или 3,6 нмоль Рi/мг белка в мин (Rhoda B. et al., 1974);эритроцитов собак – 0,5 мкг неорганического фосфора /мг белка в мин (Agnes F.et al., 1980); эритроцитов лошади, кролика, овцы, крысы и человека – активностьфермента колеблется от 0,44 до 5,7 ед/1012клеток (Palma F., Ligi F., SoverchiaC., Fioritti A., 1991).Доказано, что на активность фермента значительно влияет соотношениеионов Nа+ и К+ в среде.

Так, еще Dransfeld H. et al. (1966) обнаружили два пикаАТФазной активности скелетных мышц в зависимости от соотношения ионовNа+ иК+. Авторам удалось показать, что наличие пика в области низкихконцентраций ионов Nа+ и высоких концентраций ионовК+ являетсяследствием наложения двух ферментов - Са²+ - АТФазы и Nа+, К+ - АТФазы,каждый из которых небезразличен к природе и концентрации одновалентныхкатионов в среде инкубации.Однако, в литературе, посвященной исследованию Nа+, К+ - АТФазыскелетных мышц, существует разногласие по поводу оптимальных для Nа+, К+ АТФазы соотношений Nа и К.

Ряд авторов, применяя кратковременнуюэкстракцию хлоридом калия, отмечали пик активности фермента присоотношении Nа/К – 6-10 (Dransfeld H. et al., 1966; Ash A.S., Schwartz A., 1970;Gupta S., Phipps K., Ruderman N.B., 1996).Использование повторных и длительных экстракций солями калияприводило к смещению максимума в область указанных соотношений, равную1,4 – 2,4 (Sulakhe P.V. et al., 1971; Ткачук В.А., Болдырев А.А., 1974; Keillor J.W.,Jeneks W.P., 1996). Оптимальным условием для активации АТФазы являлось32соотношение Nа : К в среде равное 1 : 10 (Delamere N.A., Dean W.L., StridamJ.M., Moseley A.E., 1996).Repke K.P.

et al. (1971) в своих работах показали тесную связь междуоптимальным отношением Nа/К и оптимумам рН для активности Nа+, К+ АТФазы, установив, что при изменении условий экстракции мембранныхпрепаратов сердечной мышцы происходит изменение оптимума рН Nа+, К+ АТФазы. Авторы также обнаружили, что при соотношении Nа/К равном 70/70,оптимум Nа+,К+ - АТФазы лежит в нейтральной области рН. Повышениесоотношения Nа/К до 120/20 сдвигает оптимум в область щелочных рН, аснижение соотношения Nа/К до 20/120 – в область кислых значений рН (RouslinWilliam, Broge Charles W., 1989; Pagliarani A., Ventrella V., Ballestrazzi R. et al.,1991).Исходя из вышеизложенного можно заключить, что неоднозначностьрезультатов исследований по поводу оптимальных для Nа+, К+ - АТФазыскелетных мышц величин соотношения Nа/К объясняется как различнымиметодами выделения мембран, так и разными значениями рН, при которыхизменялась зависимость ферментативной активности от соотношения Nа/К.Работами Вишнякова С.И.

(1988), Рыжковой Г.Ф. (2005), Мосягина В.В.(2011) выявлен оптимум рН для Nа+,К+ - АТФазы мембран эритроцитовкрупного рогатого скота, который составляет 7,8-8,0; изменение рН средызаметно снижает активность фермента.По данным Kakinuma Joshimi, Igarashi Kazuej (1990) рН среды оказываетвлияние на активность Nа+,(повышение рНК+ - АТФазы бактерий Streptocoecus faecalisактивирует фермент примерно в 4 раза). Максимальныезначения активности наблюдались при рН 9,5 минимальные- при рН 6,0.Исследованиями ряда авторов выявлена зависимость активности Nа+, К+ АТФазыоттакихфакторовкак:концентрацияАТФитемператураинкубационной среды (Skou J.

Ch., 1979; Вишняков С.И., 1988); осмотическоедавление в организме (Watanbe K., 1982); сильное лазерное излучение (МорозА.М., 1983); -рентгеновское (Матюшичев В.Б., Таратухин В.Р., Ашмарин И.П.,33Кулева Н.В., 1974), микроволновое и ионизирующее (Fisher P.D., PoznanskyM.J., Voss W.A., 1982; Древаль В.И., 1993) облучение клеток; ионизирующаярадиация (Дворецкий А.И. и др., 1989); высокочастотные электромагнитныеполя (Blank M., 1994, 1995).Симония Г.В. и др.

(1992) доказали на активность фермента оказываетстимулирующее воздействие применение таких препаратов как карнозин, 2хлораденозин (Turkozkan N. et al., 1996) и других (Huang N., Ahmed A.H., WangD., Heppel L.A., 1992; Tukel S.S., 1995).В мембранах эритроцитов, обработанных детергентами, максимальныйуровень активности Nа+, К+ - АТФазы достигается в присутствии в качествегомолизирующего агента 1,5 мг/мл Nа дезоксихолата (Charalambous A.M., AfzalM.M., 1982).Присутствие лизолeцитина резко повышает активность АТФазы (в 18 раз);при этoм увеличивается не только максимальная скорость, но и возрастаетсрoдствo фермента к АТФ (Swanljung P.

et al., 1973; Файзулина Ф.Р., Гареев Р.А.,1991).По данным ряда авторов (Samaha F.J. et al., 1966; Болдырев А.А., 1977),появление свободного Мg²+ резко активирует оуабаин-зависимый гидролизаденозинтрифосфата, при этом ионы Мg²+ изменяют состояние липидов,окружающих молекулу Nа+,К+ - АТФазы, чеми повышают активностьфермента. Кроме того, ионы Мg²+ в присутствии ионов Nа+ на первом этапеактивного транспорта стимулируют фосфорилирование фермента, усиливая егоактивность (Pomero P.J., Whittam R., 1971).Ионы Са²+ в опытах Rohani F., Welty J.D., Hastings D.F. (1982) сиспользованием Nа+, К+ - АТФазы, изолированной из головного мозга хомячка,в концентрации 10-6 - 10-7М стимулируют активность фермента и, наоборот,более высокие концентрации Са²+ (10-5 – 10-3 М) ингибируют ее.Работами Орлова С.Н., Покудина Н.И., Котелевцева Ю.В. (1987),выявлено, что в присутствии 50 мкМ Са²+ происходит 50%-е ингибирование Nа+,К+ - АТФазы эритроцитов, Са²+ в концентрации 10-20 мкМ оказывает34ингибирующеедействиетакжеинаанионнуюаденозинтрифосфатазу.Однако, Са²+ в концентрации 0,2-2,0 мМ дозозависимо активирует Nа+, К+ АТФазу, выделенную из плаценты человека (Matsuda J., Maemori M., Tobari J.,1989).Исследованиями установлено, что специфическими ингибиторами Nа+, К+- АТФазы служат: оуабаин-строфантин -G (Wiley J.S., 1967; Наточин Ю.В., 1969;Clasen T., Hansen O., 1982; Khan B., Bhat P., 1982; Болдырев А.А., 1985; HamlynJ.M., Hamilton B.P., Manunta P., 1996; Peng M., Huang L., Hie Z., Huang W.H.,Askari A., 1996); олигомицин, уксусный ангидрид (Tukel S.S., 1995); гепарин(Karli K.J., 1984); диметилсульфаксид, дигитонин (Щеглова М.В.