Диссертация (Структурные и каталитические свойства ферментов перекисного окисления липидов – 1215-липоксигеназ)

ФЕДЕРАЛЬНОЕ ГОСУДАРСТВЕННОЕ БЮДЖЕТНОЕОБРАЗОВАТЕЛЬНОЕ УЧРЕЖДЕНИЕ ВЫСШЕГООБРАЗОВАНИЯ«МОСКОВСКИЙ ТЕХНОЛОГИЧЕСКИЙ УНИВЕРСИТЕТ»На правах рукописиИвановИгорь ВладимировичСтруктурные и каталитические свойства ферментов перекисногоокисления липидов – 12/15-липоксигеназ02.00.10 – биоорганическая химияДиссертацияна соискание ученой степенидоктора химических наукМосква – 2016ОГЛАВЛЕНИЕОГЛАВЛЕНИЕ……………………………………………………………………………...……..2ВВЕДЕНИЕ………………………………………………………………………………………...6АКТУАЛЬНОСТЬ ПРОБЛЕМЫ И ЦЕЛЬ РАБОТЫ…………………………………………..7НАУЧНАЯ НОВИЗНА………………………………………………………………………….…8ПРАКТИЧЕСКАЯ ЗНАЧИМОСТЬ……………………………………………………….……...9АПРОБАЦИЯ РАБОТЫ И ПУБЛИКАЦИИ………………………………………………….…9ЛИЧНЫЙ ВКЛАД АВТОРА…………………………………………………………………..…..10ВЫПОЛНЕНИЕ РАБОТЫ…………………………………………………………………..……10ОБСУЖДЕНИЕ РЕЗУЛЬТАТОВ И ЛИТЕРАТУРНЫХ ДАННЫХ…………………….....…12Глава 1.

Структурные основы катализа под действием LOX………………………….....121.1. Липоксигеназы млекопитающих представляют собой единуюполипептидную цепь, которая организована в виде двухдоменнойструктуры; в низших организмах встречаются гибридные белки…………...141.2. Малый N-терминальный домен LOX является важным структурнымэлементом, отвечающим за мембранное связывание и каталитическуюактивность…...……………………………………………………………………….171.3.

С-Терминальный домен LOX содержит субстрат-связывающий карман икаталитически активное негемовое железо…………….................…….…....181.4. Междоменная подвижность как источник структурной гибкости LOX……...201.5. Связывание лиганда с активным центром 12/15-LOX кролика приводит кконформационным изменениям белковой матрицы……………………….....201.6. Субстрат-связывающий карман LOX является гидрофобной полостью свыходом на поверхность белка………………………………………….………..221.7.

Молекулярный кислород проникает в активный центр LOX посредствомстрого контролируемых механизмов…………................................................261.8. Первичная структура LOX играет ключевую роль в реакционнойспецифичности окисления жирных кислот………………………………...……271.9. Антароповерхностный характер и стереоконтроль липоксигеназнойреакции………………………………………………………………………………..281.10. Геометрия трех ключевых аминокислот определяет позиционнуюспецифичность 12/15-липоксигеназ (концепция триады)…………………….311.11.

Реакционная специфичность 15LOX2 человека и ее ортолога (8S-LOXмыши) не может быть объяснена концепцией триады……………………….331.12. Реакционная специфичность изоформ LOX зависит отэкспериментальных условий.…………………………………………………......341.13. Суицидальная инактивация LOX…………………………………………………341.14. Аллостерический характер LOX………………………………………...………..371.15. Структура LOX в растворе…………………………………………………………382Глава 2. Эволюция LOX…….………………………………………………………………......402.1. Гены, кодирующие последовательность липоксигеназ, обнаружены вэукариотах и бактериях, но не найдены в археях…………………………......402.2. Существует ли общий прототип LOX?............................................................422.3.

Биологическая роль изоформ LOX……………….……………………………...43Глава 3. Будущее и перспективы развития исследований в области структурнойбиологии LOX…………………………………………………………………………..44Глава 4. Химический синтез зондов активного центра липоксигеназ............................474.1. Полный химический синтез терминальных и субтерминальныхзамещенных производных арахидоновой кислоты…………………..….….…474.1.1. Синтез региоизомерных по положению гидроксигруппы терминальныхацетиленов……………………………………………….…………………….…484.1.2. Синтез замещенных оптически активных производныхарахидоновой кислоты…………………..……………………………………...504.1.3.

Синтез терминальных и 2 субтерминальных замещенныхпроизводных арахидоновой кислоты……………………………………….544.2. Синтез зондов активного центра на основе ингибиторов r12/15-LOX……..55Глава 5. Изучение взаимодействия r12/15-LOX с лигандом ……………..…...……...625.1. Исследования r12/15-LOX с использованием аналогов их природныхсубстратов………………………………………………………………….……...…625.1.1. Введение фотоаффинной метки в r12/15-LOX………………………...….625.1.2. Энантиоселективное окисление r12/15-LOX региоизомеров ПНЖКгидроксилированных в субтерминальной части молекулы………….…...665.2. Исследования r12/15-LOX с использованием ингибиторовлипоксигеназного окисления …………………………………………..………....69Глава 6.

Роль кислорода в реакциях с участием липоксигеназ…….……………………726.1. Бифазный характер скорости окисления 19-НЕТЕ под действием r12/15LOX…………………………………………………………….……………………....726.2. Кинетическое моделирование и оценка кинетических параметров………..746.3. Расчетная модель механизма транспорта кислорода в 12/15-LOX наоснове симуляции молекулярной динамики и метода неявноголиганда……………………………………………………………………………..…77Глава 7.

Изучение пространственной структуры r12/15-LOX в растворе….…………..837.1. Вклад контактов между N-терминальным и каталитическим доменамиr12/15-LOX в стабильность вторичной и третичной структурбелка………………………………….………………………………….…………....837.1.1. Анализ взаимодействия N-концевого и каталитического3доменов………………………. ………..…………………………………..….837.1.2. Функциональная роль Тyr98 N-терминального домена……………..……857.1.3. Структурные изменения фермента при мутациях Тyr98 и Тyr614……….857.1.4.

Роль N-концевого домена в стабилизации подвижной 2 спирали…..897.1.5. Анализ третичной структуры и динамики конформационныхизменений r12/15-LOX дикого типа и мутантов..…………………….....907.1.6. Вклад Arg403 в стабильность структуры r12/15-LOX…………………….937.1.7. Функциональная роль Arg403 в структуре r12/15-LOX……….………….967.2.Исследование межмолекулярных контактов r12/15-LOX в растворе……..1037.2.1. Термодинамическая устойчивость димеров липоксигеназы…………...1037.2.2. Влияние внешнего окружения на структуру r12/15-LOX в растворе…..1047.2.3. Влияние лиганда на структуру и структурную подвижность r12/15LOX……………………………………………………………………...……...1067.2.4.

Исследования интерфейса в димере r12/15-LOX с применениемметода малоуглового рассеивания рентгеновских лучей инаправленного мутагенеза…………………………………………………1097.2.5. Изучение устойчивости димеров фермент-субстратного комплексаr12/15-LOX и мутантов с использованием методов молекулярнойдинамики………………………………………………………………..……….1137.2.6. Влияние межмолекулярных контактов в димерном интерфейсебелка на ферментативные свойства r12/15-LOX…………………….…1167.2.7.

Роль аминокилотных остатков 18 спирали в конформационныхпереходах r12/15-LOX……………………………….…...……………….…118ЗАКЛЮЧЕНИЕ………………………………………………………………………………...…..121ВЫВОДЫ……………………………………………………………………………………….….123ЭКСПЕРИМЕНТАЛЬНАЯ ЧАСТЬ…………………………………………………………..….125Эксперимент к главе 4………………………………….……………………………..….125Материалы и общие методы ………………………………………………..….125Методики к разделу 4.1.1……………………….……………………………..….126Методики к разделу 4.1.2……………………….……………………………..….132Методики к разделу 4.1.3………………………….…………………………..….143Методики к разделу 4.2………………………………………………………..….148Эксперимент к главе 5…………………………………………….…………………..….151Материалы и общие методы ………………………………………………..….151Методики к разделу 5.1.1……………….……………………………………..….152Методики к разделу 5.1.2…………………………….………………………..….155Методики к разделу 5.2………………………………………………………..….1574Эксперимент к главе 6……………………….………………………………………..….159Материалы и общие методы ………………………………………………..….159Методики к разделу 6.1………………………………………………………..….159Методики к разделу 6.2………………………………………………………..….159Методики к разделу 6.3………………………………………………………..….164Эксперимент к главе 7 ………………………………………………………………..….168ПРИЛОЖЕНИЯ…………………………………..………………………………………….……175СПИСОК СОКРАЩЕНИЙ………………….……………………………………………….……189БЛАГОДАРНОСТИ……………………………………………………….……………….……...191СПИСОК ПУБЛИКАЦИЙ АВТОРА ПО ТЕМЕ ДИССЕРТАЦИИ193Основные результаты данной работы изложены в следующих публикациях:Обзоры…………………….…………………………………………………………..………193Экспериментальные статьи…………………………..…………………………….……...

193Тезисы докладов на научных конференциях………………….………………..………196СПИСОК ЦИТИРУЕМОЙ ЛИТЕРАТУРЫ……………………………………………..………1995ВВЕДЕНИЕАКТУАЛЬНОСТЬ ПРОБЛЕМЫЛипоксигеназы млекопитающих (LOX) – негемовые железосодержащие ферменты– непосредственно связаны с регуляцией физиологических процессов и липидногогомеостаза живой клетки [1-4]. Они селективно окисляют полиненасыщенныежирные кислоты (ПНЖК) с образованием серии биологически активных соединений– оксилипинов, являющихся как эффекторами активации сигналов биологическогоответа на то или иное событие, происходящее на внутриклеточном уровне, так имежклеточнымивторичнымимессенджерами,действующимипосредствомсигналов трансдукции [5-10].

Расшифровка генома человека показала наличиешести функциональных генов, кодирующих структуры различных липоксигеназныхизоферментов, которые отличаются по своим структурным и функциональнымсвойствам [11]. 5-LOX вовлечена в биосинтез лейкотриенов и, тем самым, играетважную роль в патогенезе воспалительных и аутоиммунных заболеваний [10, 12,13]. Другие изоферменты, такие как 12- и 15-LOX, и их продукты принимаютучастиевпроцессахвозникновенияиразвитияатеросклероза[14,15],дифференциации клеток и их метастазирования [16-19], а так же воспаленияжировой ткани и возникновения резистентности к инсулину [20, 21].

Ключевая рольлипоксигеназ в патогенезе воспалительных и гиперпролиферативных заболеванийсделала их потенциальной мишенью при лечении многих заболеваний. Напротяжении последних 20 лет были предприняты многочисленные попыткисоздания препаратов на основе ингибиторов биосинтеза оксилипинов. Так,ингибиторы 5-LOX [22] и ряд антагонистов рецепторов лейкотриенов в настоящеевремя получили допуск к медицинскому применению в качестве «анти-астматиков»[23,24].Что касаетсягруппыингибиторов изоферментов 12-и 15-LOXмлекопитающих, то ни один из препаратов, предложенных на их основе, не прошелклинических испытаний вследствие их низкой специфичности и ряда побочныхэффектов [25]. Необъясненными остались аллостерические свойства 12/15-LOX,которыепредусматриваютфермента лигандом,неналичиеальтернативныхукладывающихсявединственного субстрат-связывающего центрарамкимеханизмовактивацииобщепринятоймоделифермента.