Автореферат (Структурные и каталитические свойства ферментов перекисного окисления липидов – 1215-липоксигеназ)

На правах рукописиИванов Игорь ВладимировичСтруктурные и каталитические свойства ферментов перекисногоокисления липидов – 12/15-липоксигеназ02.00.10 – биоорганическая химияАВТОРЕФЕРАТдиссертации на соискание ученой степенидоктора химических наукМосква – 2016Работа выполнена на кафедре химии и технологии биологически активных соединений им. Н.А.ПреображенскогоИнститутатонкиххимическихтехнологийФедеральногогосударственногобюджетного образовательного учреждения высшего образования «Московский технологическийуниверситет».Научный консультант:Профессор, доктор химических наукМягкова Галина ИвановнаОфициальные оппоненты:Директор Федерального государственногобюджетного учреждения науки «Казанский институтбиохимии и биофизики» КазНЦ РАН,академик РАН, профессор,доктор химических наукГречкин Александр НиколаевичВедущий научный сотрудник НИИ ФХБим.

А.Н.Белозерского Федеральногогосударственного бюджетного образовательногоучреждения высшего образования«Московский государственный университетим. М. В. Ломоносова», доктор химических наукСудьина Галина ФедоровнаДиректор НИИ молекулярной медициныФедерального государственного бюджетногообразовательного учреждения высшегообразования «Первый Московскийгосударственный медицинский университетим.

И.М. Сеченова» Минздрава России,профессор, доктор биологических наукЗамятнин Андрей АлександровичВедущая организация: Федеральное государственное бюджетное учреждение науки «Институтбиохимической физики им. Н. М. Эмануэля» РАНЗащита диссертации состоится 26 декабря 2016 г. в 15 часов на заседании диссертационногоСовета Д 212.131.06 на базе Федерального государственного бюджетного образовательногоучреждения высшего образования «Московский технологический университет» по адресу: 119571,г. Москва, пр. Вернадского, д.86, аудитория М-119.С авторефератом диссертации можно ознакомиться на Интернет-сайте ВАК РФhttp://vak.ed.gov.ruСдиссертациейможноознакомитьсявнаучно-техническойбиблиотекеФедеральногогосударственного бюджетного образовательного учреждения высшего образования «Московскийтехнологический университет» по адресу: 119571, г.

Москва, пр. Вернадского, д.86 и на сайтеwww.mirea.ru.Автореферат разослан «»2016 г.Ученый секретарь диссертационного Совета,с.н.с., к.х.н.Лютик А.И.2Общая характеристика работы1Актуальность проблемы. Липоксигеназы млекопитающих (LOX) – негемовыежелезосодержащиеферменты–непосредственносвязанысрегуляциейфизиологических процессов и липидного гомеостаза живой клетки. Они селективноокисляютполиненасыщенныежирныекислоты(ПНЖК)собразованиемсериибиологически активных соединений – оксилипинов, являющихся как эффекторамиактивации сигналов биологического ответа на то или иное событие, происходящее навнутриклеточномуровне,такимежклеточнымивторичнымимессенджерами,действующими посредством сигналов трансдукции.

Расшифровка генома человекапоказала наличие шести функциональных генов, кодирующих структуры различныхлипоксигеназныхизоферментов,которыеотличаютсяпосвоимструктурнымифункциональным свойствам. 5-LOX вовлечена в биосинтез лейкотриенов и, тем самым,играет важную роль в патогенезе воспалительных и аутоиммунных заболеваний. Другиеизоферменты, такие как 12- и 15-LOX, и их продукты принимают участие в процессахвозникновенияиразвитияатеросклероза,дифференциацииклетокиихметастазирования, а так же воспаления жировой ткани и возникновения резистентности кинсулину.Ключеваярольлипоксигеназвпатогенезевоспалительныхигиперпролиферативных заболеваний сделала их потенциальной мишенью при леченииряда заболеваний.

На протяжении последних 20 лет были предприняты многочисленныепопытки создания препаратов на основе ингибиторов биосинтеза оксилипинов. Так,ингибиторы 5-LOX и ряд антагонистов рецепторов лейкотриенов в настоящее времяполучили допуск к медицинскому применению в качестве «анти-астматиков». Чтокасается группы ингибиторов изоферментов 12- и 15-LOX млекопитающих, то ни один изпрепаратов, предложенных на их основе, не прошел клинических испытаний вследствиеих низкой специфичности и ряда побочных эффектов. Таким образом, хотя биологическаяроль большинства изоформ 12/15-LOX млекопитающих достаточно хорошо изучена,многолетние усилия в области структурно-функциональных исследований этой группыферментовдоНеобъясненныминастоящегоосталисьвременинеувенчалисьаллостерическиесвойстваполноценнымуспехом.12/15-LOX,которыепредусматривают наличие альтернативных механизмов активации фермента лигандом,неукладывающихсяврамкиобщепринятоймоделиединственногосубстрат-связывающего центра фермента.

Главной причиной подобных неудач может служить тотСписок сокращений, использованных в автореферате: LOX – липоксигеназа, ПНЖК –полиненасыщенные жирные кислоты, АК – арахидоновая кислота, Ме-АК – метиловый эфирарахидоновойкислоты,ЛК – линолеваякислота,ЕТЕ – (5Z,8Z,11Z,14Z)-эйкоза-5,8,11,14тетраеновая кислота, НЕТЕ – (5Z,8Z,11Z,14Z)-гидрокси-эйкоза-5,8,11,14-тетраеновая кислота,13(S)-H(p)ODE – (13S,9Z,12Z)-13-гидро(перо)ксиоктадека-9,12-диеновая кислота, 15(S)-H(p)ЕТE–(15S,5Z,8Z,11Z,13Е)-15-гидро(перо)ксиэйкоза-5,8,11,13-тетраеноваякислота,HMPA –гексаметилтриамид фосфорной кислоты, BODTCM – метилоый эфир 2-бензилиден-3-оксо-2,3дигидробензо[b]тиофен-7-карбоновой кислоты, pss – фотостационарная смесь, КД – круговойдихроизм, МРР – малоугловое рентгеновское рассеяние, PDB – банк данных 3-D структур белков инуклеиновых кислот; GdnHCl – гуанидин гидрохлорид13факт, что большинство гипотез и стратегий в области исследований 12/15-LOXосновывались на данных статической кристаллической структуры комплекса 15-LOXкролика (r12/15-LOX) с лигандом активного центра (PDB: 2P0M), не уделяя при этомдолжного внимания динамике внутри- и межмолекулярной организации фермента вфизиологической среде.Цели и задачи исследования.

Цель настоящей работы заключалась в созданииконцептуально новой структурно-кинетической модели, в основу которой положендинамический характер взаимодействия этого фермента, как с субстратом ПНЖК, так и совторым «неявным лигандом» - кислородом - в условиях конформационной подвижностибелковой матрицы как ключевого элемента, определяющего взаимосвязь структурафункция. В качестве объекта исследования была выбрана 12/15-LOX кролика (r12/15LOX), фермент, который по своим структурно-каталитическим свойствам наиболее близокк 12/15-LOX человека (h12/15-LOX).

Для достижения поставленной цели, в первуюочередь, было необходимо охарактеризовать структурные элементы белка, вступающие внепосредственное взаимодействие с субстратом в физиологической среде. Для этого, наначальном этапе исследований предстояло предложить дизайн и разработать синтеззондов активного центра фермента, наиболее близко отражающих структуру природныхсубстратов/лигандов LOX и способных вступать в ковалентное связывание с ферментом,а также оптимизировать технологию введения метки в молекулу r12/15-LOX. После этогопредстоялоболеедетальноизучитьрольвтороголипоксигеназногосубстрата,молекулярного кислорода, в ферментативной реакции r12/15-LOX и механизмы еготранспорта в активный центр фермента.

Обобщающим звеном в рамках поставленныхзадач явились исследования в области внутри- и межмолекулярной организации r12/15LOX в водном растворе, в том числе, в присутствии лиганда.Научная новизна:-Предложен дизайн и разработана стратегия полного химического синтеза зондовактивного центра LOX на основе новых региоизомерных аналогов арахидоновойкислоты, содержащих азидогруппу в качестве фотоаффинной метки.-С использованием полученных соединений изучены механизмы взаимодействия вряду фермент–субстрат и впервые показана возможность непосредственного участиякислорода в процессах активации r12/15-LOX.

На основе компьютерногомоделирования молекулярной динамики с участием малых молекул созданаэкспериментально подтвержденная модель, описывающая механизмы транспортакислорода в белковой матрице r12/15-LOX.-Впервые с применением комбинированной стратегии направленного мутагенеза,малоуглового рентгеновского рассеяния (МРР), кругового дихроизма и динамическойфлуоресценции проведено детальное изучение внутри- и межмолекулярнойорганизации r12/15-LOX в растворе.-Впервые показана возможность динамического равновесия мономер-димер междумолекулами r12/15-LOX, а также образования переходного димерного комплекса этого4фермента в присутствии лиганда в растворе.

Полученные данные позволяютпредположить, что в переходном димере r12/15-LOX обе молекулы фермента могутработать совместно, контролируя и координируя процессы связывания с субстратом идиссоциации продукта.Практическая значимость-Полученные результаты являются основой для формирования стратегии поискановыхпотенциальныхантиатеросклеротическихипротивовоспалительныхлекарственных препаратов.-Предложенная междисциплинарная платформа может быть применена при изученииорганизации и функционирования биологических макромолекул в растворе.-Разработанные теоретические подходы для оценки энергии распределения идинамики диффузии кислорода могут быть использованы для изученияраспределения других малых гидрофобных молекул, таких как NO, CO, CO2 вструктуре макромолекул.-Разработаннаястратегиясинтезаприродных(-4)-гидроксилированныхпроизводных арахидоновой кислоты через ацетиленовые предшественникиобеспечивает возможность выхода к целому ряду новых перспективных, в том числемеченых тритием соединений, и возможности реализации комбинаторного подходапри их получении.Основные положения, выносимые на защиту:1.

Изучение механизмов взаимодействия r12/15-LOX с лигандом активного центрафермента. Разработка новых подходов и стратегий в синтезе зондов активного центрафермента LOX наиболее близко отражающих структуру природного субстрата.2. Изучение механизмов транспорта второго «неявного лиганда» – кислорода и его рольв ферментативной реакции r12/15-LOX.3.