Рыбчин - Основы генетической инженерии - 2002 (947310), страница 77
Текст из файла (страница 77)
ео11, содержащего ген ТК вируса осповакцины. В этот гец был встроен промотор ранних генов вируса осповакцины, к которому присоединили ген ОВюАе, Полученной таким образом рекомбинантной плазмидой трансформировали клетки обезьяны, инфицированные одновременно вирусом осповакцины. В ряде клеток произошла рекомбинация между вирусной и плазмидной ДНК по области гомологии в гене ТК. Рекомбинантные вирусы осповакцины, ставшие мутантными по тимидинкиназе, отбирали по фенотипу негативных колоний на клетках ТК в присутствии 5-бромдезоксиуридина (В()дК, аналог тимидина). Такие вирусы синтезировали продукт гена НВхАл. После вакцинации кроликов рекомбинантным вирусом в их крови появились антитела к поверхностному антигену вируса гепатита В.
Успешно были вакцинированы и шимпанзе (Мозв ега1., 1984). Аналогичным образом были сконструированы рекомбинантные нирусы оспонакцины„придающие хомякам устойчивость к заболеванию гриппом (Бпи1Ь ег а1., 1983Ь), а лисам — к заболеванию бешенством (В1апсов ег а1., 1986). Современные векторы 402 Часть 111.
Экспрессия чужеродных генов содержат во внедряемом фрагменте наряду с целевым геном также селективный маркер, обычно пео или «рв Селективпые среды для этих маркеров блокируют репликацию вирусной ДНК, поэтому только рекомбинанп~ые вирусы образуют негативные колонии. тк Вирусная ДНК Гомоне гичесная Реяомбии анна ньяи Реаомбннаитиая вирусная ЛНК Рис. 13.3. Схема конструирования рекомби- вантпого вируса осповакпииы. Х вЂ” места яолюлогичсской рекомбинации Напомним, что вирус осповакцины развивается в цитоплазме. Поэтому в рекомбинантных вирусах важно использовать для экспрессии чужеродных генов вирусные промоторы. С помощью вирусных РНК-полимераз они позволяют избегать различных процессов, которые происходят в ядре и которые затрулняк>т экспрессию — сплайсинг„полиаденилирование, транспорт через ядерную мембрану.
На порядок эффективнее промоторы фага Т7, но в этом случае в клетке должна присутствовать система, экспрессирукяцая РНК-полимеразу этого фага. Вспомогательные плазмиды, используемые для конструирования рекомбинантных вирусов, полезны сами по себе в опытах, в которых достаточно наблкадать временную экспрессию клонированных генов.
Ретровиуусы. Как уже отмечалось в гл. 2, ретровирусы обладают однонитевой РНК, но их жизненный цикл обязательно проходит через стадию образования лвунитевой ДНК 1см. рис. 2.7), Глава 13. Животные 403 что позволяет использовать их для генно-инженерных операций, Как векторы они обладают определенными преимугцествами. Вопервых, у них искл|очительно широкий круг клеток-хозяев Вовторых, струкгура интегрированной ДНК ретровирусов исключает возможность перестройки клонировацного в ней гена (зто часто случается при интеграции н клеточные хромосомы ДНК других вирусов). В-третьих, при ретровирусной инфекции клетки не погибают и в течение многих генераций продуцируют вирусы, что дает возможность в случае клонирования в ретровирусах чужеродных генов создавать продуценты, постоянно синтезирующие заданный продукт.
К недостаткам слелует отнести низкую концентрацию получаемых вирусных суспензий (105 — 10' частиц в ! мл культуральной среды) и свойство вирусов развиваться только н делящихся клетках, что не позволяет использовать его для большинства дифференцированных клеток. Вмешательство н геном ретровируса приводит к его дефектности. Однако если в нем сохранить концевые понторы ЬТК и сайты Р, Ри, рл и Я, действующие ьл сй 1рис. 2.7; назначение сайтов описано в гл.
2), то недостающие функции рекомбинантного вируса могут быть компенсированы продуктами, поставляемыми ьл Лала вирусом-помощником или специальными линиями клеток. Конструирование рекомбинантных ретровирусных геномов ведут в клетках Е. сой с помощью плазмидных векторов, в которых клонирован провирус (рис. 13.4). В таких челночных векторах селективный (~шя животных клеток) и целевой гены обычно находятся под вирусным промотором, расположенным в левом ЬТВ, но можно клонировать их с другими промоторами.
Селективный ген удобно интегрировать вместо локуса епк В зтом случае его трансляция будет происходить с мРНК, образующейся в результате сплайсинга по 5-сайтам геномной РНК. Рекомбинантной плазмидой трансформируют подходящую линиюю животных клеток, одновременно инфицируя их вирусом-помощником. В плазмиде будет трацскрибиронаться только ее провирусная часть с клонированными генами, так что инфицированные клетки будут производить смесь дефектных (рекомбинантных) и недефектных вирусов. Отметим, что интроны, 404 Часть П!. Экспрессия пугкероднгкх генов содержащиеся в клонированных генах, удалюотся в процессе созревания рекомбинантных вирусов, и в дальнейшем гены существуют в безынтронном виде.
Рис. 13.4. Строение челночного ретро- вирусного вектора. Тройной линией выделена провирусная ДНК. Стрелками показаны геномный !а) я субгеномный 1б; сплайсинг по Льсайтам) а транскрипты провируса ее ' Функции, недостающие дефектному рекомбинантному вирусу, могут поставляться также резидентным провирусом. Удобны для этой цели провирусы, у которых нарушен процесс сборки вириона. Такой провирус вируса лейкоза мышей Молони (Мп1.Н) содержится в мышиных клетках линии )Ч)Н ЗТЗ !Мапл ег а1, 1983). Трансформация этих клеток рекомбинантпыми плазмидами, выделенными из Е сой, позволяет получать чистый препарат рекомбинантных вирусов. Инфицирование ими нормальных клеток приводит к образованию рекомбинаптного провируса, его интеграции в хромосому н экспрессии целевого гена.
Адеяови1оусы. У челове.ка аденовирусы инфицируют предпочтительно клетки эпителия верхних дыхательных путей, приводя к образованию доброкачественных опухолей. Они ипфицируют также большую гамму делящихся и неделя1цихся (диффереш1ировапных) животных клеток, вызывая их гибель. Вирусы проникают в клетку путем рецептор-опосредованного эндоцитоза и, разрушив эндосому, оказываготся в цитоплазме. Их двунитевая линейная ДНК длиной 36 т.н.н. гранскрибируется и реплицируется в ядре. Аденовирусы удобны в качестве векторов, так как: 1) имекгг широкий круг клеток-хозяев; 2) размножаются до 10' вирусов на клетку, образуя приблизительно 10н частиц в 1 мл культуральной среды; 3) обеспечивают высокий уровень экспрессии, поскольку клетки остаются живыми до поздних стадий инфекции; 4) их ДНК пе интегрируется в клеточнук> хромосому, минимизируя тем самым риск активации онкогенов.
У вирусов очень Глава 13. Животные 405 сложная система транскрипции ранних и поздних генов, что сужает возможность замещения вирусных генов на клонировщшые. Удобен для этой цели локус Е1, отвечающий за репликащпо вирусной ДНК. В векторе он замещен на экспрессионную кассету, вмещающуаэ до 6 — 8 т.п.н. чужДНК. Создана линия клеток, в которых локус Е1 конститутивно экспрессируется. В таких клетках дефектные по этому локусу аденовирусцые векторы способны реплипироваться и образовывать зрелые вирионы.
При инфекции ими нормальных клеток векторная переплицируюгцаяся ДНК сравнительно долгое время поддерживается в ядре в плазмидпом состоянии, позволяя экспериментировать с изучаемыми генами. Бакулоаируськ Эти вирусы ипфицируют насекомых. При своем развитии они образуют в клеточном ядре белковые тела вклкы чения, состоящие в основном из полиэдрина, гец которого обладает мощным промотором (ра ). Именно этот промотор используют для экспрессии в клетках насекомых клонированных генов. Большой размер генома бакуловирусов (около 130 т.п.н.) вынуждает использовать такой же метод конструирования рекомбинантных вирусов, как и при работе с вирусом осповакцины (см. рис. !3.3). Для работы с вирусом ядерного полиэдроза АиГорарйа еа1(гоглат (АсМ)чРЪ) фирма '"!пт(ггойеп" предлагает в качестве вспомогательного вектора плазмиду рВ(цеВасН(з2 с вариантами Л, В и С для разных рамок считывания (рис.
135). Экспрессионцая кассета, включакзщая в себя информацию о полигистидиновом тракте, сайте деиствия энтерокиназы ЕК и эпитопе Ер( (см. гл. 10), а также сайт поликлопирования МСБ, подчинена промотору р „. С одной стороны кассета флацкирована вирусным геном ОКЕ!629, а с другой — 5'-частью гена 1асХ, управляемого вирусным промотором р, (еаг!у-го-!а1е, переключение с ранних функций на поздние).
В вирусной ДНК рядом с геном ОКЕ!629 внедрена 3'-частыена !ага, частично перекрывающаяся с его 5'-частьк>, находящейся в плазмиде. Экспрессионная кассета, содержащая клонируемый ген, оказывается в составе вирусной ДНК после ее гомологической рекомбинации с плазмидой гд г1то. Рекомбинантный вирус отыскивается по голубой окраске негативных колоний, 406 Часть 11!. Экспрессия чужеродных явное являющейся следствием активности восстановленного гена !асс.. Система обеспечивает эффективную очистку синтезированных белков и получение их в индивидуальной форме (см. гл.
!О). Рис. !3.5. Строение вспомогательной плазмиды В!пеВасНьз2, используемой для конструирования рекомбинантных бакуловирусов. ВК-в!я Знак С в дуплексе — иниции- рующий колон для синтеза гибридна, ного белка; МС5 — полилинкер для встраивания целевого гена оп' т р Пыазмидиые векторы В целях обеспечения возможности конструирования рекДНК в клетках Е. сой плазмидные векторы для работы с животными клетками делают челночными.
Отметим, что в области 2067 — 2533 п.н. плазмиды рВВ322 есть "ядовитая"' последовательность, препятствующая репликации челно гных векторов в животных клетках. Она отсутствует в ряде ее производных, в частности, в плазмиде рАТ153 (см. рис.
7 3), которые и следует применять для соответствуюших конструкций. Реиликатпар вируса ЯУ40. Первый из таких векторов, плазмида рЯ~2, содержит репликатор вируса ЯЪ'40 и его раннюю экспрессионную кассету, а также Есой1-Ргц11-рестрикт плазмиды рВВ322, включаюший оп'-сайт и маркер Арх (Мц)!18ап, Вегй, 1980; 198!а,Ь). Вирусная часть вектора состоит из трех фрагментов. Фрагмент РуаН-тт7патИ (342 п.н.) содержит опсайт и промотор гена А, рядом с которым можно внедрять чужеродный ген. Второй фрапмент несет малый 1-интрон.
![](https://s.studizba.com/z.php?f=/templates/si/i/noavatar.png&w=100&h=100&t=1"){kind=avatar}
