Рыбчин - Основы генетической инженерии - 2002 (947310), страница 79
Текст из файла (страница 79)
Число копий гена в клетке у разных особей варьировало от 1 до 150. Транс- генные мыши передавали ген ТК' своему потомству, но количественно характер экспрессии у разных потомков был различным. Прелполагается, что это вызвано вариациями метилирования или сгрукзуры хроматина в сайтах интеграции генов. Аналогичным образом была осуществлена регуляция экспрессии геномного гена гормона роста крысы (6Н), помещенного в плазмиде рМС)Н под промстор гена МТ и сохранившего свой сайт полиаденилирования (рис. 13.9).
Фрагмент рекомбинантной плазмиды с экспрессионной кассетой был инъецирован в мужской пронуклеус 170 оплодотворенных яйцеклеток мыши. 21 мышь дала потомство. Треть потомства содержала гены 6Н, число Глава 13. Животные 413 Рис. 13ль Рекомбиназпная плазмила рМСН, ~несущая ген гормона роста бИ крысы пол контролем промотора гена металлотионина-1. р „— промотор гена металлотионина-1; рЛ „— сайт полиаленилирования гена гормона роста он ан Данный гормон секретируется.
Его концентрапия в плазме крови превышала в 100 — 1000 раз его нормальное содержание в плазме крови транс- генных животных и была много выше, чем в клеточных культурах, сконструированных для производства того же гормона. Поэтому был поднят вопрос о возможно большей экономичности технологии получения генно-инженерных продуктов от животных-доноров, чем от клеточных (бактериальных или животных) техноло! ий.
Описанная работа способствовала многочисленным попыткам применить этот метод для увеличения веса животных, надоев молока и т.п. Метод мнкроинъекции ДНК в цитоплазму оплодотворенных яйцеклеток оказался единственным эффективным способом получения трансгепных рыб. Наибольшее число попьгпж связано с введением геномных генов или кДНК гормонов роста человека и форели.
Во многих случаях было показано, что гетерологичные гены интегрируются в клеточную ДНК, передаются потомству и экспрессируются, приводя к ускоренному развитию рыб и увеличению их веса (см. обзор Озеп, Ротчегз, 1990). Ии4ицировпвиеретровиуусами. Метод технически прост: рекомбинантный вирус добавляют к 8-клеточному эмбриону, лишенному защитной оболочки (хопа ре11пс!ба), и затем вволят его "приемной'* матери. К недостаткам следует отнести мозаичность которых в клетках разных линий мышей изменялось от ! до 35. Пропорционально менялась и концентрация самого гормона, причем в данном случае его синтез слабо зависел от добавляемого в пишу цинка. Избыточное количество гормона способствовало развитию гигантизма: наиболее крупные особи были тяжелее нормальных животных почти в два раза (Ра1гпйег е! а)., 1982).
4!4 Часть П1. Экспрессия чужерпдпих генов получаемого потомства и, конечно, потенциально возможную экспрессию клеточных генов под влиянием вирусных (.ТК. Использование эмбриональных сенвалааых клеток. Уже подчеркивалось, что чужДНК интегрируется в клеточные хромосомы в случайных локусах при любом способе ее введения. При работе с трансгенными животными, полученными с помощью вышеописанных методов, это означает вынужденную констатацию такого факта и его последующий анализ.
Действительно, в данном случае провести предварительный анализ результатов интеграпии чужДНК на уровне зародышевых клеток невозможно, поскольку необходим этап культивирования. Положение спасают различные культивируемые линии эмбриональных стволовых клеток.
Уже говорилось (см. гл. 5), что они являются плюрипотентными и у взрослых животных дают начало мно|им типам клеток, включая зародышевые. Таким образом, можно трансформировать эти клетки рекДНК или инфицировать рекомбинантным ретровирусом, отобрать желаемую линию, а потом перенести рекомбинантное ядро с помощью микропипетки в оплолотворенную яйцеклетку, из которой затем улаляют оба пронуклеуса. Полученное потомство будет трансгенным.
При необходимости, перенося ядра генотипически одинаковых плюрипотентных клеток, можно создавать клоны трансгенных животных. Перенос рекомбинантных стволовых клеток в бластописты и последующая имплантация последних *'приемным" матерям приволят к появлению химерных потомков (рис. 13.10,а,б,в). У взрослых животных доля тканей, происходящих из внесенных стволовых клеток, варьирует в широких пределах от эксперимента к эксперименту; такой тканью может быль и зародышевая. Для вьивления этого случая животных скрегцивают с особью нормального генотипа и анализируют потомство на появление в нем рекомбинантных признаков (рис.
13.10,г,д). Такие особи будут трансгенными гетерозиготами. Эмбриональные стволовые клетки используют также для получения трансгенных животных, у которых произведено замещение какого-либо гена на его аллель. Дл 1 исследования свойств мутантных аллелей, в том числе нуль-аллелей, крайне важно, чтобы Глава 13.
Живоглвые 415 в,- ° ВМ~ 46ЬФ' ГомОзйУОтв~юа ~ Имбрнхннг ~ жьво~яыс Рис. 13.10. Метод получения линии траисгснных мышей с использованием эмбриональных стволовых клеток. Эмбриональные спюловые клетки (ЕЯ)взяты у мышей„гомозиготиьгх по гену, определяющему черный цест шерсти, н введены в бластоцисту мыши-альбиноса (а), которая затем имплантируется "приемной" матери (б).
Это приводит к появлению химерных потомков (е). Их скрешиванис с альбиносами (г) помогает выявить по цвету гшерозиготные особи (д), у которых зародышевая ткань произошла ст стволовых клеток Инбридинг среди этих особей позволяет получить гомозиготных потомков (е). Если в геном сгволовых клеток бьп введен какой-либо ген, то полученные особи будут трансгснными 41б Часть 1П, Экспрессия чужеродных гение они находились в обычных для них локусах.
Естественным методом замещения является гомологическая рекомбинация, но у животных этот процесс происходит крайне редко. При трансформации клеток гомологичной ДНК она преимущественно интегрируется в случайных локусах, и только небольшая часть внедрений (1О-' — 10') происходит благодаря рекомбинации через гомологичный сайт. Частота голюлогической рекомбинации пропорциональна размеру взаимолействующих участков и достигает насыщения (100-кратного увеличения частоты) при длине около 14 т.п.н., причем рекомбинация происходит главным образом в ранней Б-фазе.
Рис. ! 3.11. Двухзтапный метод замещения аллелей в эмбриональных стволовых клетках с помощью гомологической рекомбинации: а — рекомбинация лиежлу плазмилой и хромосомой, приводящая к лупяикации искомого гена; б — в~ ~угри- хромосомная рекомбинация, приводящая к удалению муганпюго аллсяя гена. Замел)ающий аллель зачернен, замещаемый анхель выделен тройной линией; * — замещаемая мутация. Горизонтальной двунаправленной стрелкои обозначен удаляемый' сегмент дупликации.
Вектор, несущий сслективные ~сны С)с и пео, лиыеаризован А х в ) ~ У~~а««вость 041 а Чу сто ст «ВГАЦ А осо ск в б) ) Чуосокотнысость к 04ГВ ф Устойч«ность к НАЦ А в Для вы))везения этих редких событий предложено использовать специальный вектор, содержащий в качестве селективных маркеров ген лес и ген г)с вируса простого герпеса (рис. 13.11).
Прис)тствие последнего в клетках деляг.г их чувствительными к аналогам нуклеозидов ганцикловиру и 1-(2-дезокси-2-флюоро-1)-1)- арабинофурансззил)-5-йодоуридину (г(Л()). В вектор встраивают Глава 13. Жлвоткце 417 желаемый аллель, причем из-за того, что частота гомологической рекомбинации несколько выше для линейной ДНК по сравнению с кольцевой, предусмотрена линеаризация вектора в области внедряемого гена (Начгу ег а1., 1991). Клетки трансформируют рекомбинантным вектором, а трансформанты отбирают по устойчивости к С418 и проверяют на чувствительность к Р1А(3.
В трансформантах, в которых интеграция рекомбинантного вектора в хромосому произо~ш~а за счет гомологической рекомбинации, целевой ген тандемно дуплицирован. Поэтому в них с определенно(! частотой происходит внутрималекулярная рекомбинация, сопровождающаяся вьпцеплением векторной вставки вместе с селективными генами. Такие клетки отбирают по устойчивости к Р1АЬ и проверяют на чувствительность к С418. Появление в клетке другого аллеля определяют методом ПЦР (см. приложение). Далее отобранные стволовые клетки переносят в бластоцисты и с помощью '*приемных** матерей получают химерных потомков, гегерозиготных в некоторых тканях по исследуемому гену.
![](https://s.studizba.com/z.php?f=/templates/si/i/noavatar.png&w=100&h=100&t=1"){kind=avatar}
