Рыбчин - Основы генетической инженерии - 2002 (947310), страница 76
Текст из файла (страница 76)
С помощью таких векторов наблюдают их временную экспрессию. Двунитсвая кольцевая ДНК этого вируса содержит 5243 п.н. (рис. 13.!). Отсчет нуклеотидов ведут по часовой стрслкс от слинственного ВВй-сайта, расположегпюго в ог(-сайте. Слева от огысайта находится ранний ген А, кодирующий два белка 39б Часть П ! Зкенреесил чулеероднмх генов !Т- и 1-антигоны). Эти белки необходимы д.п! репликации ви!зусной ДН К. Справа от олнсаита располагаются три перекрывающихся поздних гена, содержащих информацию о синтезе структурных белков Ъ"Р1, Ъ'Р2 и УРЗ. Ранний и поздние гецы транскрибируются с одного двунаправленного промотора, локализованного рядом с огйсайтом.
0н включает в себя три гандемных ЬС-богатых гювтора, содержащих но 21 п.н., участок, Сюгатый АТ-нарами (ТАТА- участок), и два тацдсмцых повтора по 72 п.н. Последние являются энхансером одновременно для ранней и поздней транскрипции. оп' ми~С Поздняя мРНК 4 - . Промотор - -- ". !ь- - — — . в. ТАТА ®ЫЛМ 5193 524321 50 100 0 те! А, Рис. 13 !.
Схема транскрипции ДНК вируса бзУ40 н строение се промоторной области Координаты па генепеческой карге и в области промотора указаны в п.н ; А — полнадепиловал послеловвгельностгй волнистыми линиями показаны участки первичных транскриптов, улаляемгле при сплайсннге; цифры в кружках обозначают число пар нуклеотидов в повторах Глава ! 3. Жалование 397 Ранний псрвичный транскрипт подвергается альтернативному сплайсингу, приводящсму к образованию двух типов мРНК, которыс обеспечивают си5псз Т- и 1-антигенов.
На Х-концах обоих белков располагаются одинаковые послсдоватсльности, состоящие из )(2 аминокислот, а последующие аминокислотные послсдовательности в бслках различны. Белок Т-антигон играет двойную роль. Его посадка на ог(-сайт инициирует репликацию БЧ40 ДНК, а при достижении опрсделснной концснтрации он связывастся с ближайшим к оп-сайту повтором из 21 п.н. и блокирует раннюю транскрипци)о.
Поздний первичный транскрипт также подвергается альтернативному сплайси!иу, образуя мРНК трех типов — !6Б, 18Б и 19Я, которыс определяют синтез белков ЧР1, ЧРЗ и ЧР2, соответспюш ю. Н~па аКУ (768) ! (1708) Вец (З770) Вмащ(855 ) Всащ (!787) Рис. ! 3.2. 07нзичсскал карта аЧ40 ДНК и строеннс вирусных векторов аЧОТ! (а) и ЯЧСТ5(д) Жирным шрифтом выделены елинственныс сайты рестрикции; координагы указаны в п.н.; стрелками показаны ранний (левосторошшй) и поздний (правосторонннй) трию- крипты.
рА — саит полналенвлирования 398 Часть Ш. Экспрессия чужеродных генов Для конструирования первых векторов использовали рестриктазы и сайты рестрикции, приведенные на физической карте БЧ40 ДНК (рис. 13.2). Векнеоры с замещением поздних генов КЬ'40ДНК. Первые попытки конструирования вирусных векторов были осуществлены с вирусом Я~40, в ДНК которого нет протяженных спейсеров. В вирусном геноме замещали на чужДНК поздние или ранние гены.
Полученные конструкции являлись векторами замещения с емкостью нс более 2,5 т.п.н., причем для работы с ними требовался вирус-помошник. Вектор БЧОТ1 (рис. 13.2, а) был получен путем удаления из вирусной ДНК поздних генов с помощью единственных сайтов НраИ и ВатН1 (Оо)Т, Вегв, 1976). С использованием АТ-коннектора в него был встроен подхолягций по размеру фрагмент ДНК фага е.. Образовавшаяся рекДНК была введена в клепси грансфекцией совместно с ДНК вируса-помощника Я~40гзА, имеющего термочувствительную мутацию в репликационном гене А.
В результате при 41 С развиваются оба вируса, так как в клетках имеются кодируемые вектором ранние, и кодируемые фатом-помощником поздние вирусные белки. Вирус, содержащий рекДНК, можно выделить и использовать для дальнейших манипуляций. Однако этот вектор оказался непригодным для экспрессии клонируемых генов, так как синтезирова1щые мРНК были крайне нестабильны.
Причина неудачи была выяснена после изучения свойств вектора ЯЧОТ5 (рис. 13.2,б). Он был получен путем удаления из области поздних генов БЧ40 ДН К ИнаП1- ВащН1-фрагмента, содержащего кодирующую часть белка ЧР1. В векторе сохранились поздний промотор, а также сигналы сплайсинга и полиадепилирования лля 166 мРНК (НниЛП-сайт располагается в 50 п.ц.
после интрона, а Вап~Н1-сайт — в 50 п.н. до терминирующего кодона). Авторы (МиП1йап ег а(., 1979) клонировали в векторе БЧСТ5 кДНК и геномный геп В-глобина кролика. В обоих слу аях происходили созревание мРНК и синтез белка, неотличимого от природного 1т-глобина.
При клонировании геномного гена оказалось, что синтез мРНК может инициироваться и терминироваться на соответству1оших вирусных или геномных сайтах и что при этом на обеих мРНК идет синтез белка. Было также обнаружено, что Глава 13. Живоеиные 399 для образования стабилыюй зрелой мРНК необходимо присутствие интрона либо в лидерном участке пре-мРНК„ происходящем из вирусной ДНК, либо в гене глобина.
Причина этого пока не выяснена. Извеспю только, что одни клонированные мозаичные гены могуг, а другие не способны эффективно экспрессироваться в животных клетках, если у них удалены ицтроны. В этой работе фактически впервые в эукариотическом векторе была сконструирована экспрессионная кассета и получены важные результаты, которые с тех пор учитываются при конструировании векторов, предназначеешых для экспрессии чужеродных генов в животных клетках. Зксегресеиолнал кассета. Вазовыми элементами эукариотической экспрессионной кассеты (транскрипционного модуля) являются промотор и сайт полиаденилирования, в котором формируется 3'-конец транскрипта.
Напомним, что он определяет у ~веток, где происходит отшепление "хвоста" транскрипта и его полиаденилирование (см. гл. ! ). Дополнительными элементами кассеты служат энхансеры и инзроны. В отличие от сигналов процесси~га мРНК, которые функционируют эффективно во всех типах клеток животных, детальное строепис промоторов и энхансеров значительно варьирует у разных генов.
Многие энхансеры активны только в определенных тканях или действуют только в присутствии определенных факторов (см. гл. !). Эти обстоятельства следует у читывать при выборе или конструировании векторов. Наиболее универсальны вирусные энхансеры, из которых широко используются энхансеры вирусов ЯЪ'40 и саркомы Рауса (ЙЯЪ'). Сигналы сплайсинга хотя и универсальны, но не безразличны к прилегаклцим к ним экзонным последов пельностям. В случае конструирования рекДНК, в транскрипте которой будут соединены не взаимодействующие в норме сигналы сплайсинга, сплайсирование может быть неточным. Апробирование различных эукариотических экспрессионных кассет было проведено путем их конструирования в составе плазмиды рВВ322 и последующим наблюдением временной экспрессии после трансформации клеток.
400 Часть 111. Экспрессия яу.ясродньяя генон Для достижения высокого уровня зкспрессии чужеродных генов в животных клетках следует учитывать некоторые правила (Кохах, 1984; 1986): вторичная структура в 5'-нетранслируемой области мРНК препятствует зффективной трансляции; кодои А(ЗО в 5'-нетранслируемой области мРНК мешает правильному инициирукицему кодоиу; консенсусом около инициирую1цего кодона у высших зукариот является последовательность СС(А/О)ССА()ОО. Отмечено, кроме того, что присутствие АЬ-богатой области в 3'-петраислируемой области мРНК уменыиает ее стабильность (Впав, Кап1еп, 1986). Векторы с замещением ранней области БУ40ДПК. Конструирование векторов с делецией части гена А (дефектность по Т-функции) стало возможным после создания линии СОВ-клеток (производная от линии почечных клеток обезьяны Ся'-1). В хромосоме зтих клеток содержится ген А вируса 8'у40 (О!иашап, 1981).
Введение в СОВ- клетки векторов и рскДНК такого типа ведет к нормальному литическому циклу, т.е. ие требует привлечения вирусов-помощников. Экспрессиоииой кассетой служат ранний промотор и сайт полиаденилироваиия, а также малый 1-интрон. В процессе работы с таким типом векторов выяснилось, что СОЯ-клетки поддерживают репликацию кольцевой ДНК, содержащей опссайт вируса ЯЪ40, вне зависимости от ее размера.
Этот вывод стал отправным для создания плазмидных векторов. Вирус основакаииы. Этот вирус облалает двунитевой ДНК, отличающейся уникальным строением. Она представляет собой линейную молекулу, на обоих концах которой имеется ц|пилька, замыкающая ковалентио обе нити ДНК (см. для примера рис.3.1,в). Транскрипция и репликация ДНК происходят в цитоплазме, поскольку вирус обладает всей нужной для зтого информацией, а ряд необходимых белков содержится в самом вирионе.
Вирус осповакцииы привлекателен в качестве вектора по нескольким причинам. Во-первых, у него широкий спектр клеток- хозяев (от позвоночных до беспозвоночных). Во-вторых, его большой геном (187 т.п.и.) позволяет внедрять фрагменты чужДНК размером до 25 т.п.н. В-третьих, его безопасность подтверждена Глава 13. Животные 401 двухвековой практикой использования для вакцинации людей против нируса оспы. Техника вакцинации проста и рассчитана на применение в массоном масштабе. Поэтому было предложено вводить в геном вируса осповакцины гены, кодирующие белкиантигены различных болезнетворных вирусов (микробов), и использовать образующиеся рекомбинантные вирусы для вакцинации лк~дей и создания у них иммунитета к другим (наряду с оспой) инфекционным заболеваниям.
Впервые эта идея была использована для клонирования и экспрессии в ДНК вируса осповакцины гена поверхностного антигена НВзА8 вируса гепатита В (Бш(1Ь ег а1., 1983а). Большая величина вирусного генома затрудняла конструирование рекДНК ьл г1гго. Поэтому сначала была создана вспомогательная плазмида, в которой чужеродная вставка была фланкирована частями вирусного гена тимидинкиназы (ТК) и которая затем была встроена в вирусную ДНК гн г1го через этот ген (рис. 13.3). Конструирование плазмиды было выполнено с помощью одного из плазмидных векторов Е.
![](https://s.studizba.com/z.php?f=/templates/si/i/noavatar.png&w=100&h=100&t=1"){kind=avatar}
