Рыбчин - Основы генетической инженерии - 2002 (947310), страница 74
Текст из файла (страница 74)
Раетелпл 385 когда необходимо просто определить, есть ли экспрессиз! кло нируемого гена и какова ее эффективность. В таких случаях после трансформации клеток о!раничиваются детектированием кратковремешюй (папз1еп!) экспрессии гена, не добиваясь получения стабильных трансформантов, у которых рекЛНК интегрирована в клеточный геном. На уровне целого организма при получении трансгенных растений возникает проблема тканеспецифической регуляции экспрессии клопированных генов. Известно, что тканеспецифичность экспрессии определяется набором регуляторных сайтов в предпромоторной области гена, с которыми взаимодействуют транскриппионные Факторы, а также энхансерами и сайленсерами, расположенными по обе стороны гена.
Такие сигналы сохраняют свою Функциональность при межвидовых переносах. К примсру, ген Фазеолина (запасной белок) фасоли со своим 5'-концевым участком размером около1 т.п.н. был перенесен с помощью Т1-плазмиды в табак. В трансгепном растении этот ген экспрессировался только в семенах и только в стадии молочной спелости, т.
е. точно там и тогда, где этот ген транскрибируется в самой фасоли (Бепявр!а-Сора(ап ег а!., 1985) Регуляторные сайты идентифицируют с помощью присоединяемых к ним генов-репортеров. Так называют гены, чьи продукты определяются с помощью простых и чувствительных методов (колориметрия, флюоромегрия, люминометрия, радиометрия) и чья активность в растительных клетках в норме отсутствует. К таким генам относятся пат и ось, но чаще других используют уже упоминавшиеся селективные гены са! и пео, а также ген Е со(! ийЛ (он же 6(Г5), кодирующий В-гл!окуронидазу. Этот фермент катализирует расщепление широкого ряда В-глюку!юнидов, многие из которых являются хромогенными субстратами, что позволяет проводить чувствительные количественные тесты гп тчтго, !п иве и Гп ящ (гистохимически).
Изучаемую регуляторную область соединяют с геном-репортером путем транскрипционного или трансляционного слияния (рис. 12.б). В первом варианте образуется индивидуальный фермент, во втором — гибридный, причем лишние аминокислоты не мешают проявлению репортерной Функции. 386 Часть П1. Зкскреогля яужвробтлгх гелвв РА ТАТА САР АТО г-:.
г сллт З) -80 -00 пзь -40 -20 ТАТА СЛР Лтй тлтл сАР Атп Рис. 126. Схемы присоелцпския гека-репортера к регуляторцои области исследуемого растительного гена: а — регуляторная область растительного гека, 6 трансляционное слияние; в — трвкскрипцкоцкое слггятие СААТ и ТАТА-- консервативкьге последовательности промотора, САР— область качала транскрипции, кодирояаьие кзпцировакия, рА — сайт цолиалекклкровакия, г1срггым цветом выделена последовательность гека-репортера С помощью такого подходя были исследованы рег)гляторньге обласги ядерных генов гЬсЯ (кодирует малую субъединицу рибулозо-1,5-бисфосфаткарбоксилазы/оксигеназы) и саЬ (кодирует хлорофилл а/Ь связующий белок). (Отметим лля корреюгности, что оба гена приналлсжгп разным мультигенным семействам.) Оба белка после синтеза транспортируются в хлоропласг, гле входят в сосгав свепюобирающего комплекса тилакоидных мембран и учасгвуют в фотосинтезе.
Поэтому экспрессия их генов органоспецифична и индуцирустся светом через посредство фитохромов (белки-фоторсцепторы). Для выявления структуры регуляторных областей их делеционные варианты присоединяли к генам-репортерам саг или лес и исслелогяцги их экспрессию в разных органах трансгенных растений петунии или табака (сами гены были взяты из гороха). Было выяснено, что, например, чувствительность гена гЬсВ к свету определяется только ТЛТЛ-боксом (первые 33 п.ц.
промотора), а тканеспецифичность зависит от участка с координатами приблизителыю от -1050 до — 350 (Вгодйе ег а!., !9(14). В этом участке найдены энхансеры и сайлецсеры. Наиболыцая активность белка-рсгюртера обнаруживается в листьях, меньшая — в стебле, отсутствует в корнях. Глава 12. Растелив ЗК7 -Ф Р1 Ря врпт оояяв РА4 Рис. ! 2.7. Схема б4инарного вектора рРСЧ701, предназначенного для экспрессии бактернальных генов 1ихА н гих11.
р,ир, — промоторыгенов1 и2 Т„-ДНК;р и р,— промоторы генов логи 5Т,-ДНК; РА„РА,и РА, — сайты полиаденнлирования генов 4, 7и оси опТ и опУ вЂ” сайты начала репликации и конъюгациоцного переноса плазмиды РКК2. Стрелки показывают направление транскрипции. Знаки Р'в дуплексе обозначают прямые концевые повторы Т-ДНК В качестве репортерных применяются и гены 1их бактерии Ибпо Лаггеу( и светлячка Рйогглих ругай, кодирующис люцеферазу (см. гл. 7). У бактерий люциферазная активность обеспечивается двумя генами„входягцими в один оперон, но с целью экспрессии в растительных клетках в бинарном векторе РРО7701 (рис.
12.7) 1ихА и 1ихВ поставили под разные промоторы, промоторы р, и р, генов Г и 2' Т„-ДНК (см. рис. 12.1). Оба гена находятся в пределах прямых концевых повторов одной и той же Т-ДНК, что необходимо для их одновременного введения в одну ЗЗХ ~!аст! Н1. Эксг!/!естя чуз!серег!лмх генея и ту жс клетку. Кроме генов /их в Т-Д11К внедрены сслсктивныс маркеры д;ш растений (прй1) и Е.
соЯ (А/зк). Поддержание всктора в клетках А. /цл!е/Вс/ела осу!цсствлястся 1зенликатором нлазмиды рКК2, номегце! !ным вне Т-ДНК. Рекомбипантньгй вектор вводили в растителы!ыс клетки или нротонласты табака и моркови либо с номощг,го агроб!а!с!срий, либо т(зансформацией изолированной ДНК. Во всех слу щях трансгенныс растения экснрсссировали гены /их (Конек е/ а/., 19Х?), что свилстсльствовало об их способности ншпо собирать гстсродимерный комплекс бактсриальных белков. Интересно отметить, что <ужсродные белки могут выполнять в растительных клетках и рсгулягорную роль, если их мишень внслрить в надлежащий локус (например, оператор для связывания репрессора номсстигь в промотор регулируемого !с!!а).
ВОПРОСЫ ДДЯ ПОВТОРЕНИЯ И ОБСУЖДЕНИЯ !2.1. В чем состоит особенность генетики Т-ДНК? !22. На чем основана идея коинтсгративных растительных векторов'! 12З. Какие бактсрнальные селектнвные маркеры и гены-рслортеры иснользу!от в растительных векторах? 12А. В чем преимущество бинарных распнельных векторов по сравнени!о с коинтегративными? !2.5. Почему оказалось возможным использовать бинарные векторы, не содержащие Т-ДНК? 12.6. Для каких целей и каким образом используется агроинфекц!ш? 12.7. Какие подходы используют лля !рансфорлгацци клеток однодольных растений? !2.3.
Опивцпс основныс этапы полу!ения трансгеннь!х растений. Как будет проявляться эффект ткансснецпфичностн зкснрессии чужеродного гена! Вудс ли ж!от эф!1)ект оди!ш«овым в иезависггмо нг)лученных три !сгснныл растениях? 12.9. Как отыскивакт! и исследуют регуляторныс области растительных генов? !2.10. Зная строение вектора рВш19 (рис. !2З,а), составьте план эксперимента по норе!юсу генов /их в клетки табака. Как убедиться, что перенос прошел успешно? Глава !3 животпык В рсзул3лт3те многочисленных опытов по клонированию генов животных в бактсриальных клетках были достигиу3ы сущест33СЗН3ыс успехи в рвсшг!ф(зевке их строс!!и!!. Однако их функции и ряд механизмов регулирования ткаиеспсцифической экспрссс53и гююв можно исслсдовать только в жи33он3ых клстках. Поэтому уже с первых шагов генетическая инженерия клеток животных развивалась с ориентацией иа экспрессию клоннруемых генов.
Были сконструированы подходящие для такой цепи векторы, разработаны метолы .граисформации клеток животных и способы введения отдельных генов в геномы многоклсточных организмов. Своеобразие виутриклсточиых процессов реализации генетической и!!формации у животных 3юзволяст иаблюд 3я ь эффект введения 3ужД33К ис только в случае сс стабилыюго поддержания в клсгкс, но и как временную эксиресси3о до момента се деградации. Это означает, что многие вопросы при наличии генов-репортеров можно решать, испол ьзуя векторы, которые имекзт только бактсриальные репликаторы.
В практическом плане первоочередной задачей генетической инженерии животных клеток (и в первую очередь клеток млекоиитающих) является изу кя3ие генов человека с целью ис3юльзования полученных знаний в медицине. Ввслсиис клонируемых генов в зародышевые клетки и получение трансгеннь3х животных дает возможность изучать механизмы, регулирующие экспрессию генов в процессе слпогенсза. 3-3е менее 3ижиа технология ввсдсния генов в соматические клетки.
Работы в этом направлении можно охарактеризовать как поиск путей генной 3ерации, т. с. замены мутаитиых генов их нормальными аллелями. Решение данной проблемы особенно важно, поскольку уже известно около 390 Часзь П1. Зкы1ргееив чуэгеродвых генов 5000 наследственных заболеваний человека, и во многих случаях только ввслсние "злорового" гена может привести к устранению генетического дефекта. Другой практически важной проблемой является конструирование пролуцснтов лекарственных препаратов полипептидного строения. Дело в том, что многие животные белки при их синтезе в бактсриальных или дрожжевых клетках неправильно молифицируются и/или приобретают измененную пространственную структуру, в связи с чем проявляют слабую активность либо вообще неактивны.
Например, бактерии нс могут осузцествлять такис постграпсляционпые модификации эукариотичсских белков, как гликозилированис, фосфорилированис, точное образование лисульфидных связей, специфический протсолиз, олигомсризацию и т. п.
ТРАнсфОРмАция клетык Гсппо-инжснерныс методы в применении к животным клеткам свели вместе два разных смысла термина "трансформация": введение в клетку изолировашюй ДНК с различными для клетки последствиями и псрерожасние клетки из нормальной в онкогсннукк Во втором его смысле в рамках данной главы будем применять термин "онкотрансформация". Онкотрансформацию вызывает ряд вирусов нри инфицировании или трансфскции ими клеток ~в частности, широко используемый в генно-инженерной практике вирус Я~40).
зхульгаиаируемые клетки. Для характеристики трансформирующей ДНК используют стандартныс клеточные культуры— челове абоские клетки Не).а (рак шейки матки, эпителиальный тип), Фибробласты мышей 3Т3 или ЗТ6 или же клетки печени мыши ~1-клетки). При выборе новых экспериментальных моделей крайне важно подобрать условия культивирования клеток. Клетки, растущие в монослое, болсе полхолящий объект лля трансформации, чем клетки, кульгивируемые в суспензии. Для выделения клеток из монослоев применяют трипсин.
Селектиааые маркеры и гены-репортерьа В гл. 5 уже отмечалась ограниченность спектра сслективных маркеров, используемых лля отбора трансформировашгых животных клеток. Это, Глава 13. Жяватвьи 391 во-первых, гены, пролукты которых осушсствлшот метаболизм азотистых оснований — гены гипоксантингуанинфосфорибозилтрацсферазы (НЬР1Л), адспинфосфорибозилтрансферазы (АРВТ) и тимидинкиназы (7 К). Реципиентагви в этом случае могут служить только мутантные клетки. Во-вторых, это более 20 генов, обеспсчиваюших селекцию в случае их мультипликации. Наиболее известен ген дигилрог)юлатрсдуктазы (гП(Тг). В-третьих, это гены бактериального происхожлсния зрг и лес (см.
гл. 5), поставленные пол вирусный промотор. Напомним, что ген лев придает клеткам устойчивость к антибиотику С!418 и используется как селективный маркер также при работе с клетками лрожжей и растений. Удобство двух нослслних групп маркеров в том, что они позволяют работать с немутантпыми клетками. Гены-рено)зтеры благодаря простоте определения их экспрессии широко использучотся дзи исследовательских целей.
Для работы с клетками животных удобны уже упоминавшиеся в гл. 12 гены саги (ах, а также гсп )аса.. Ка~ы1ив-(роефатвьй меглод. Этот метод транс<)юрмации клегок живот~и гх изолировшпюй ДНК был вйе)звые использован! егце в "эпоху" ло гешсой инженерии (ЯауЬа!зка, ВауЬа!зИ, 1962).
![](https://s.studizba.com/z.php?f=/templates/si/i/noavatar.png&w=100&h=100&t=1"){kind=avatar}
