Рыбчин - Основы генетической инженерии - 2002 (947310), страница 70
Текст из файла (страница 70)
в Е 1.; =-.= Рло!а гсаи ватт!! Е 1РХ-а! ) Рис. 11.7. Схема опыта по клонированию и зкспрсссии в дрожжах человеческого гена лсйконитарного интерфсрона 1Е1Ч-а1.  — Вол!Н1; Š— ЕсоИ Збб с(есть П !. Экснрегпсв нужероднвсх генов Экспрессию чужеродных генов в дрожжах, как и в бактериях, проводят с получением гибридного или индивидуального белка (см. рис. ! 0.2). Первым индивидуальным животным белком, синтезированным в дрожжах, был человеческий лсйкоцитарный интерфсрон 1Г1ч-а! (Нйвсгпап ес а1., 1981). Его кДНК была поставлена под контроль промотора гсца алкогохсьдегссдрогсназы дрожжей АХЭР11 (рис.
1!.7). С этой целью из плазмиды, в которой был клонирован ген АГАП!, в результате нескольких последовательных процедур выделили сто промотор в составе ВаосН1-ЕсоК1-рестрикта и встроили его в плазмиду рГК1.4, являющуюся производной всктора Ъ'Кр7. Полученная плазмида рГКР имела единственный ЕсоК!-сайт, поэтому ген 1Р1х'-ст! был подготовлен лти клонирования в виде ЕсоК1- рестриктов. Исходссая кДНК интсрфсрона 1Г(х(-с.! содержала последовательность с информацией о сигнальном псптидс. Она была заменена синтетическим двунитсвым олигонуклсотидом, имсюшим ЕсоК1-сайт и инициируюпсий кодон АТО. 3'-концевая нетранслируемая часть кДНК имела естественный ЕсоК1- сайт, что и позволило осушествить клонирование гена 1РЙ- сс1. Для повьсшения эффективности образования рскДНК линсаризованпыс плазмиды рГКК предварительно обрабатывали шелочной фосфатазой.
Трансформированные дрожжевые клетки отбирали по маркеру ТВР1 и определяли в них уровень синтеза интерфсрона. Он составил примерно 10" молекул на клетку, что на два порядка больше, чем при экспрессии такого же гена в клетках Е. соГс Секреция белков дрожжами осусцествляется стандартным для эукаристг способом. После синтеза белка-предшественника его сигнальная последовательность удаляется при проникновении белка через мембрану эндоплазматической сети. Зрелый белок транспортируется в комплекс Гольджи и попадасс в мембранные пузырьки (везикулы). Всзикульс движутся к плазматической мембране и, сливаясь с ней, доставляют в псриплазматичсское пространство белки, которые "застревают" здесь или в клеточной стенке (например, кислая фосфатаза и инвсртаза) или поступасот в культуральпую среду (например, ц-фактор, см.
гл. 5). Ко- Глава ! !. Дрожжи 367 личсство секрстирусмого белка зависит от Фазы роста и максимально (около 30 %) в стационарной Фазе. Как ужс отмечалось (см. гл. 1О), си!нальныс последовательности функционально сходны у многих организмов, даже у таких отдаленных друг от друга, как бактерии и животныс. Это справедливо и для дрожжевых клеток, что было установлспо в опытах по экспрессии в дрожжах генов различных интсрфсронов человека (Н11хептап ег л(., 1983). Для клонирования использовали челночный вектор УЕр1РТ, сконструированный на базе плазмиды рВК322 и 2-микронной ДНК (рис.
11.8), несущей ог1-сай!т, а также сип!алы тсрминации транскрипции и полиаденилирования, принадлежащие гену И,Р(см. рис. 3.18). Эти сигналы оказались необходимыми для эффективной экспрессии чужеродных генов. Сслсктивным маркером служил гсн ТКР1, а промотор был взят от гена Р6К кодирующего 3-Фосфоглипсраткиназу. Под этот промотор через сдинственный ЕсоК1-сайт были внедрены гены УР1У-а1, ХРУ-а2 и УРД'-у с собственными сигнальными последовательностями. Во всех случаях наблюдалась секреция активного интсрферона, т.
е. дрожжевые клетки правильно процессируют чужие для них сигнальные последовательности. Этот вывод (за немногими иск!ючениями) был затем подтвержден для многих других животных и растительных белков. Бсок! Рис. ! 1.8. Челночный векюр УЕр1РТ для экспрессии чужеродных генов в дрохсках. Внешней стрелкой обозначено направление транскрипции с промотора р .; рЛ вЂ” сайт полиадснилировання Для секреции дрожжевыми клетками чужеродных белков, нс имеющих собственной сигнальной последовательности, конструируют специальные векторы, которые кодирукп такие последовательности. Так, для синтеза и секреции человеческого Зб>3 Часть Н1.
Зкс»г>ессня нуо>се!>одних генов Рис. !1.9. Строение вектора Убрвес!, с помощью которого был осуществлен синтез и секреция человеческого интсрле>!кипа-1б клетками Х сеген>в>ае. Вне>нпсй стрелкой обозначено направление транскрипции с промотора р, „. 88 — сигнальная последо- вательность ТВ оп 2мкн | гйпди Ра>! зад Ван>Р!! Рч Бп>ат Многие секретирусмые эукариотическис белки гликозилируются в определенных сайтах при прохождении их через эндоплазматический ретикулум и аппарат Гольджи. Состав олигосахаридов различен в белках животных, растений и дрожжеи. Как показали опыты, чужеродные белки гликозилируются в дрожжах в обычных для себя сайтах, но содержат олигосахариды дрожжевого типа.
Необычное гликозилированис нс сказывается на активности белков ьч игго, однако при тсрапс>тгичсском применении эта разница может сказаться на их стабильности, ил>л>унесенности и других эффектах. интсрлсйкина-1!) клетками Х сеген>а)пе был использован вектор т'Ерасс! (рис. ! 1.9), который содержит синтетический олигонуклеотид 88, кодирующий сигнальную последовательность из 18 аминокислот секретируемого токсина дрожжей КЫунеготусеа !пети. Олигонуклеотид, фланкированный в процессе синтеза по разные стороны инициирую>цим кодоном и полилинксром, встроен вслед за сильныл! промотором гена СУС! цитохрома С Х сесе»>у>ае.
Ему, в свою очередь, предшествует транскригшионный активатор 1)А8-6АЕ, индупируемый галактозой. кДН К интерлейкина-! 1> была подсоединена через полилинкср в рамке к сигнальной последовательности. При росте в галактозной среде клетки, содержащие рекомбинантную плазмиду, секретировщи в культуральную среду до 1 — 2 мг/л интер- лейкина-11> практически без примеси других белков (ВаЫаг! е! а1., 1987). Глава ! 1. Дрожжи 369 Клонирование и экспрессия генов в мицеляльных грибах Техника клонирования и экспрессии чужеродных генов в других дрожжах и мицеляльных грибах мало отличается от методов, разработанных лля х. аегев(з(ае.
Конечно, принимается во внимание особенность биологии мицеляльпых грибов. Она заключается в том, что растворимые вещества, включая макромолекулы (но нс органсллы), более или менее свободно циркулируют между клетками по практически общей цитоплазмс. В связи с этим генетическую сслекцию нельзя применять к индивидуалыюму ядру и надежно поддерживать векторы во внсхромосомном состоянии. Причина проста: ядра, нс содержащие плазмиды, будут делиться за счет веществ, которые поступа1от от ядер с плазмидами. Из-за этого большинство векторов являкхтся интегративными.
Отметим и другую сложносты у мипсляльных грибов хромосомные и митохондриальные репликаторы А1(Х неэффективно функционируют в плазмидных векторах, а собственныс плазмиды в их ядрах не обнаружены. Из-за недостаточной генетической изученности большинства видов мицеляльных карибов возможносгь применять для селекции трансформантов биохимические маркеры крайне ограничена. Более удобны маркеры, применение кгхгорых не связано с генотипом клеток.
К их числу относятся маркеры Вепв из Атрехя(Пиг тг)и(ат (устойчивость к фунгициду беномилу), а((С из А, п(яег (устойчивость к олигомицину), ать из А. тг(и(апз (использование ацетамида в качестве единственного источника азота). Распространение получили и бактериальныс маркеры, поставлснные под промоторы грибов (устойчивость к антибиотикам ~игромицину, блсомицину, канамицину, О418 и др.).
Способы трансформации мицсляльных грибов сходны. Их клеточные стенки устойчивее дрожжевых, поэтому для получения протопластов используют препараты, содержащие смесь гидролитических ферментов. Наиболее распространен %хуохуше 234, полученный их гриба 2)усйао(егта гггЫае, в котором главными компонентами являются 1,3-глюкгн1аза и хитиназа. 370 Часть 11!. Зкспдвссин нзонвоодньь генов Экспрессия гстсрологичных генов в мицеляльных грибах нс г5ызываст проблем, если гены г!роисходят из одной !руппы грибов, например аскомицстов, поскольку их транскрипционныс сип!алы взаимозаменяемы.
![](https://s.studizba.com/z.php?f=/templates/si/i/noavatar.png&w=100&h=100&t=1"){kind=avatar}
