Рыбчин - Основы генетической инженерии - 2002 (947310), страница 65
Текст из файла (страница 65)
Затем после него были последовательно вставлены последовательности, кодирующие >771- сайт, инициатор трансляции Я()-АТС, пептидный линкер (Рг1>-Т)> ) „, из десяти череду>ощихся остатков пролина и треонина, а также сайт поликлонирования Н1лгЛП-ВатШ-Лас1-Есор. 11ептидный линкер предназначался дтя соединения гибкой связью двух доменов гибридного белка. С помощью вектора Л(оо были клопированы и экспрессированы в клетках Е.
сойти)> ген!акХ и растительный ген ВРА ВаиЬтш 7>агригеа, а их продукты 1>-галактозидаза и лектин были эксгн>нированы на поверхцости фап>вых частиц. В клетках Е. гой хггр' синтезировались, коне шо, свободные белки. Схема событий при экспрессии гена К представлена ниже. ХХ '-ТАО -ВВ! -В(>-АТО-(Рго-Т>>г) „, - Инг1! Бс Вот!11 -1асХ- Веог>! У - Бао1- Егор! .
ввр'; ).-р>>' — пептидный линкер — 1>-галактозидаза; вцр'. ).-рУ' + пептидный линкср — б-галактозидаза. 1>-1алактозидазу можно отщепить от фага или пептидного лин- кера с гюмощыо коллагеназы. Экспрессия прокариотвческих генов ЭФФективность экспрессии при клонировании в бактериальных клетках собственных генов или генов близкородственных организмов зависит главным образом от силы выбранного промотора, поскольку сайт связывашля рибосом содержится, как правило, в клонируел>ых генах. Отличия в системах транскрипции-трансляции начинают сказываться при клонировании бактериальных генов, взятых из клеток отдгцченных видов.
Было выявлено, по эти системы не универсальны и что они в определенном смысле асимметричны. К примеру, многие гены клеток В. хиЫ(гу выражаются в клетках Е, вой и комплементиру>от ее мутации, в то Глава 10. Бакаеряи 339 время как экспрессии генов Е. соВ в В. злбгйн не происходит. Это объясняется, во-первых, тем, гго РНК-полимераза Е, соВ "узнает" промоторы многих как грамотрицательных, так и грамположизельных бактерий, а РНК-полимераза В. зиЫй — только промоторы грамположительных бактерий. Во-вторых, взаимодействие рибосом В.
зьбййз с сайтами связывания более специфично, чем рибосом Е. гоВ. Поэтому при клонировании генов В. зиИЫ с собственными промоторами в стандартных бирепликонных векторах В. зиЬВВз — Е. соВ можно наблюдать их экспрессию одновременно в обоих типах клеток. В то же время лля экспрессии генов Е соВ в клетках В. зиИИз необходимо конструировать специальные векторы, где чужеродные гены были бы соединены с промоторами и с последовательностями 1!!айна — Далгарно бациллярного происхождения.
Например, гены трипгофанового оперопа Е. сой "заговорили" в клетках В. зиййз после их клонирования с помогцью вектора рР1.608 1см. 7.!6,6) путем внедрения в ген саб находящийся пол контролем промотора субтилисного фага ЯР02. Экспрессия эукариотических генов Из-за мозаичности строения большинства эукариотических генов их экспрессию в бактериальных клетках осугцествляют, используя их кДНК или химически синтезированную белок-колирующую часть. Для этой цели применяют одну из описанных схем конструирования рекДНК 1см. рис. 10.3), которые отличаются друг ст друга разными принципами "стыковки"' клонируемого гена с регуляторной частью вектора. Выбор нужной схемы зависит от строения гена и от экспериментальных возможностей. Впервые экспрессию эукариотического гена в бактериях удалось осуществить с использованием схемы "а-1" (1таЬта ег и1., 1977).
Авторы химически синтезировали ген гормона соматостатина, состоягций последовательно из ЕсоК!-сайта, кодона для метионина, 14 колонов соматостатина, двух стоп-кодонов и ВатН1-сайта. Ген был встроен в модифицированную плазмиду рВК322 через сайты ЕсоК! и ВивН! гена !асХ 1рис. 10.6). В результате экспрессии гена образовался гибридный белок, солер- 340 Часть !1!. Экспрессия <вокерсдньа геяов жаший семь первых аминокислот р-галактозидазы, метионин и соматостатин. Гибридный белок не прояв>гял гормональной активности.
Поэтому соматостатин отгиепили от него 1л >)гго бром- цианом, специфически гидролизу<ощим полипептилные цепочки после метионпповых остатков. Индивидуальный гормон был активным. —,Стла~Ат-лат-татаат-.Куьл:тт С й«лто т<н вэ)~ — меьА>а-О<у-Суа4.ув-лав-РЬЕ ь>в НООС -Суа -Бее-Тат-Ухе™ Рис. !0.6. Схема клонирования и экспрессии в клетках Е. со!1 химически сиитезировапного гена сомат<>статина с последу<поп<в< образоваписм актив- иои> гормоьга. р — промотор; о — оператор; 8!Э вЂ” поспело>ш- тельиость Шайна — Далп<ри<> Аналогичным образом были химически синтезированы, клонированы и экспрессированы в клетках Е.
со!< А- и В-пег<и человеческоп> инсулина (<эое<Ые! ег а1., !978). После объединения их ьч т11годисульфидными связями образовался активный гормон (рис. !0.7). По той же схеме в клетках Е. соб был экспрессирован ген пейропептила лей-энкефалина 18)>еп>уа!<!п ег и1., !980). Глава 10. Бактерии 341 Химический сикось 4 кь А-цепь, бо п.н. В.пень, Об п.н. т)ьннсформацнк К сой йЬнкукьпм экспрессии ,, ькс, ьу Мс! Мс! "' А --"в Ъ Обьелинении цепей Б-Б м Аа Ьок.. око СОО А-цепко 2! нмвноьоьсооко Б Б ! ! Б Б ХЫ ич иоь м» ьио» и В-цепь, Зс ннинокисппг ! Рис. 10.7. Схема клонирования и экспрессии в клетках Е сод химически сиьпезироваьшых А- и В-цепсй инсулина с последующим созданием активно! о гормона. р — промотор; ь — инициирующий кодов; — терминирующий кодов В приведенных примерах целевые белковые продукты не содержали в своем составе метионина, что позволяло использовать бромциан для их отьцепления.
В случае синтеза в клетках Е. со1ь' человеческого р-урогастрона (фактор роста эпидермиса), кото- 342 Часть В?. Зксврессия чужеродных генов рый состоит из 53 аминокислот и содержит в середине молекулы метионин, для этой цели был использован трипсин. Он ращцепляет молекулы белка около лизина и аргинина, которых нет н гормоне. При синтезе гена 13-урогастрона перед его первым кодоном поместили кодоны ААА и АЛО, соответствуюгцие лизину, что и позволило отщепить гормон из гибридного белка. Схему «а-1» используют также для обеспечения секреции целевых белков. В этом случае клонируемый ген присоединяют к последовательности, кодируюгцей ВВВ-сайт и сигнальный пептид какого-либо гена, чаще всего гена щелочной фосфатазы рйоА. Таким специализированным вектором является плазмида рТЛ!529 (рис.
10.4, е). Ве ключевая последовательность содержит 21 кодов сигнального пептида щелочной фосфазазы (выделено жирным шрифтом), за которыми следуют сайты клони?х>ванин Есой? и Еат?Н (курспн) и 57иа! (подчеркнут) Мег 1.ув 1 уз А1а2Тгр С)у 11е Рго С!у Лзр Рго СТС ААА...ААА ССТ ТСС ССА А27" ССС СС6 БЛТ СС Илс??! ЕсоИ Ати1 ВитН? Сигнальный пептид отщепляется в периплазмс сигнальной пептилазой (указано стрелкой). Перед клонированием векторную ДНК расщепляют рестриктазой НггиЛ?1 (сайт под ~е?зкнут), заполняют брешь с помслцью кленовского фрагмента ДНК-полимеразы 1 и дополнительно обрабатывают одной из трех "клонирующих" рестриктаз.
Ясно, что клонируемый ген должен иметь ровный 5'- конец, начиназо|пийся с первого колона, а 3'-конец должен быть совместим со вторым концом вектора. Так узилось добиться секреции человеческих р уро1астрона (О)са еГ а?., 1985) и а-интерферона (М!уа1се ее и!., 1985), гены которых были клонированы и экспрессиронаны в Е со!) с помощью этого вектора. Схема "б» в одноцистронном варианте (см. рис. 10.3, 6-2) была впервые использонана для создания клеток Е. со!1, продуцируюших гормон роста человека (Спеце! ег а!., ! 979). Этот гормон н клетках человека синтезируется в виде белка-предшественника. Сам гормон состоит из 191 аминокислотного остатка, а его белок-предшественник имеет дополнительно на Глава 10. Бактнерлн 343 пан(г4.191), «днк г4 гз 191.втор ~- Ннещ Ь знзз! НОН (1-г4), нпм.синтез Исо31 ЛТО-1 г .г4 н) Неен1 з- б) ЬсоИ АЖ.1гг .191.втор Неещ Рис.
![](https://s.studizba.com/z.php?f=/templates/si/i/noavatar.png&w=100&h=100&t=1"){kind=avatar}
