Рыбчин - Основы генетической инженерии - 2002 (947310), страница 66
Текст из файла (страница 66)
1О.о. Схема конструирования экспрессируюшегося в клетках Е. сол гена гормона роста человека (Н6Н): тз — клонировнпные фри~менты тапа; б — полный ген НбН г4-конце сигнальный пептид из 26 аминокислот. Клонирование и экспрессия генов, копирующих белки-предшественники функционально активных белков, имеют свои особенности, так как в бактериальных клетках процессинг эукариотических белков затруднен. В таких случаях рекДНК конструируют, заменяя начальную часть генов, копирующую отщепляемый при процессинге пептид, на инициирующий колон. Причем, если ген синтезируют полностью, то при этом предусматривают все необходимые для его экспрессии замены нуклеотидных остатков. Анализ последовательности нукчеотидов кДНК гена гормона роста показал, что его начальную часть, соответствующую сигнальному пептиду, можно удалить с помощью рестриктазы НиеИ1.
Однако в таком случае отщепляются еще 23 кодона. С учетом этого и был составлен план эксперимента (рнс. 10.8). Сначала рас1цепляли кДНК рсстриктазой Ние1У и клонировали фрагмент Д1-! К, несущий ксщоны 24 — !91. Затем химически синтезировали и клоннровали полинуклеотид с кодонами !— 24, добавив к нему инициирующий кодов АТСз, а также подходя1цие липкие концы для внедрения фрагмента в плазмиду. Далее через сайт НаеП! объединили оба фрагме1 1та (при этом восстанавливается кодон 24) и образовавшийся ген внедрили в плазмиду рВК322 рядом с промотором лактозного оперона.
Экспрессия гена была достаточно успешной — продукция гормона составила более 10' молекул на клетку. 344 Часть Ш. Знслрессая вунсеродгнех генов Для создания двуцистронной конструкции (см. рис. !0.3, б-2) перел клонируемым геном вставляют химически синтезированные терминирующи!! колон и сайт связывания рибосом.
В результате на мРНК, образовавшейся с векторного промотора, происхолит синтез полыпептила, кодируемого начальной частью векторного гена, и синтез чужеродного белка. Таким путем, к примеру, была осугцествлена экспрессия гена г-анти- гена вируса В'у40 в клетках Е. сей. С этой целью к плазмиде рВВ322, линеаризованной через Ртй-сайт, был присоединен синтетический олигонуклеотид, содержащий Рвг)-сайт, терминирую~ций колон ТАА, ЯГ)-сайт и НгиЛП-сайт: Втор ...СТСгСАОТААС!СгАССТТТААСгСТТ РзЛ Я1) Нтсй!1 Фрагмент ДНК, солержащий ген т-антигена, был "вырезан" из вирусного генома с помощью рестриктазы Нгггс!(1!.
При этом инициирующий колон гена оказался на расстоянии 12 п.н. от 5'-конца фрагмента. Для получения вариабельного количества нуклеотидов между 81)-сайтом и инициирующим колоном Фрагменты укоротили с помощью экзонуклеазы П1 и нуклеазы В1. Через образовавшиеся ровные концы Фрагменты присоелинили к молекулам линеаризованного вектора со стороны синтетического олигонуклеотида, а рекомбинантные плазмилы затем циркуляризовали и трансформировали ими клетки Е.
сей. Анализ рекомбинантных плазмил из бактериальных клонов, продуцируюших 1-антиген, показал, что изменение расстояния между сайтом связывания рибосом и колоном АТС даже на один нуклеотид резко влияет на эфФективность экспрессии гена. Современное воплощение этой идеи можно проиллюстрировать на примере высокоэффективной экспрессии синтетических безынзронных генов, кодирующих человеческие интерлейкин !а (П !а) и его рецепторный антагонист (П 1га). Авторы (В!и!сп ег а!., 1995) воспользовались станлартным вектором рбВМ-1 (см. рис. 7.5,б), который содержит промотор Глава !О.
Баюперии 345 фага Т7 и предназначен лля транскрипции ьч игго, и сконструировали на его базе вектор РАМС лля сопряженной трансляции. Для этого они синтезировали дуплекс МСЕ (рис. 10.9,а), включающий в себя миницистрон, терминирующий колон которого перекрывается со стартовым колоном второго цистрона (целевого гена), и встроили его в полилинкер по сайтам ЕсоВ! и ВитН!. Нуклеотилная последовательность в миницистроне была составлена исходя из необходимости включения в нее эпхансера и ЯР2-сайта, а также выбора оптимальных кодонов и учета рекомендаций В!оппо (!98б). Интеграция целевого гена в вектор осуществляется через Есо3!1-сайт дуплекса МСЕ и один из оставшихся сайтов полилинкера, Рестриктаза Есо311 образует четырехзвенпый 5'-выступающий конец слева от своего сайта действия (в данном случае 3'- 'Г'СС-'').
Процедура интеграции целевого ге~~а предусматривает необходимость предварительного синтеза на его 5'-конце связующего звена, включающего в себя Ехр31-сайт и последовательность, которая после действия рестриктазы Е~Р31 образует 5'-выступающий конец 5'-ААТО-3' справа от сайта. Комплементарность выступающих концов обеспечивает их объединение и лигирование (рис. !0.9,б). Трапскрипциьэ лвуцис~ронного оперона осуществляет РНК- полимераза фага Т7, по обеспечивается использованием в качестве реципиентных клеток штамма Е. со11 В1 2 1(РЕЗ). Консгрукция вектора предусматривает две возможности инициации трансляции второго цистрона. Во-первых, он может транслироваться самостоятельно, поскольку ему предшествует собственный сайг ЯР2 и энхансер трансляции, упомянутый выше.
Во-вторых, он способен транслироваться сопряженно с минипиелроном, так как рибосома, стартовавшая в сайте ЯР1, достигнув терминирующего колона в последовательности ТААТО, не отделяется от мРНК, а переходит к трансляции второго цистрона. Вектор позволил получить высокий выход интерлейкина и его антагониста (33 % и 13 % от суммарного белка, соответственно). Как показал анализ, в данном случае основной вклад в трансляцию целевых генов внес сайт ЯР2.
346 Часть !11. Зкенреесая нуэкервдньи генов И $ 3 й . ~! 4 й ,'Г~ ~ 8 ~ О „~о ~~! ~Б~ Ц1 !! а н ~ 1 ~о ~! о р о х О м * О хъ;, о со о о $ .Я о ухх л о г о о о о, о о ххс оЙх х 8 о ~М ~О Д,х с „а ххо х о БЕ1 о нсо х ~о о х М о г о х ~'., х сьо у ".О Ч о~ () х сб И Ы О „. х ~х х о о Ро.
о х Е И ! и л о С х о О' ы о,х н О э о х ! ха ~". в Е ы М х о М х с х о о, М 1лава 10. Бактерии 347 Оптимизация экспрессии генов в других бактериальных системах Необходимость разработки других систем регулируемой экспрессии генов продиктована в первую очередь погребносгями микробиологической промышленности. Из бактерий в центре ее внимания находятся клетки, синтезирующие, различныс хозяйственно важные вегцесгва (бациллы, актиномицеты и коринебактерии) или способные вести биодеградацию органических отходов (псевдо- монады). Поэтому обычно ставится вопрос о повышении экспрессии их собственных или близкородственных генов. Векторы, предназначенные для работы в таких системах клонирования, описаны в гл.
7. Уже подчеркивалось, что их делают, как правило, челночными, придавая им способность реплицироваться дополнительно и в клетках Е. со!й Это дает возможность использовать хорошо изученную сисгему для начальных этапов конструирования рекДНК и ее мультипликации, а уже экспрессию клонированных генов вести в исследуемой системе. Проблемы, возникающие при создании экспрессионных векторов, аналогичны описанным выше. Однако в таких системах оптимизация экспрессии клонированных генов затруднена, как правило, из-за плохой молекулярно-генетической характеристики этих объектов. В случае грамотрицательных бактерий выход находят в использовании репликонов цлазмид, имеющих широкий круг хозяев, и экспрессионных кассет, разработанных для Е.
сой. Например, векгор рММВ22, сконструированный на базе плазмиды В5Р1010 (см. рис. 3.13,6), содержит промотор гас и ген 1ас1", функционирующие в клетках псевдомонад. С его помощью осуществлена эффективная экспрессия гена катехол-2,3-оксигеназы в Р. РиЫа (Вар$аваг(ап е1 а1., 1984). Но схеме «а» с помехцью вектора рР1.608 (см. рис. 7.! б,б) удалось добиться экспрессии в клетках В. хиЬгйх гена е(п7г, кодирую- щего дигидрофолатредуктазу мыши, — одного из немногих эукариотических белков, которые функционируют в бактериальных клетках.
Данный фермент устойчив к триметоприму, в то время как аналогичный бактериальный фермент чувствителен к нему. Это и позволяет отбирать клетки, в которых экспрессирустся ген г(йгг (по их способности к росту при наличии в среде высокои 348 Часть 11!.
Эхсу~ресгля чужераг)лих севов концентрации триметоприма — 25 мкг/мл). Внелрение гена Й4.в вектор рР1 60() осуществлялось через (М-сайт. Суперпролуцегггы и проблема стабильности векторов В бактериальной к|етке содержится 2 — 3 тыс, различных белков, кажлый из которых сосгавляет в среднем 0,04 % от их общей массы. При клонировании и экспрессии в бактериях чужеродного гена доля кодируемого им индивидуального белка может достигать 40 %.
(Клетки, в которых эта величина составляет 2 % и более, называют суперпродуцентами; они тратят значительную часть энергии и веществ на производство ненужного лля них продукта.) В результате скорость синтеза жизненно важных для клетки белков снижается, а время деления клеток увеличивается, что затрулняет промышленное культивирование суперпродуцеьпов. Для создания оптимальных условий наращивания культуры до подходящей концентрации клеток экспрессию клонируемых генов у продуцентов включают только на поздних стадиях ферментации. Это достигается, в частности, пугем помещения экспрессируемого гена под контроль специфического оператора основного вектора, а во вспомогательном векторе клонируют ген репрессора.
![](https://s.studizba.com/z.php?f=/templates/si/i/noavatar.png&w=100&h=100&t=1"){kind=avatar}
