Рыбчин - Основы генетической инженерии - 2002 (947310), страница 68
Текст из файла (страница 68)
е. исправляющие соответствун>щие бактериальные дефекты (см. табл. 11.1). 354 Часть 1И Эксадессае чулсеродиьст генов Наиболее удобен маркер ьгЯАЗ, в котором нет сайтов для распространенных рестриктаз и для которого кроме позитивной селекции (коплементация ауксотрофных мутаций) возможна и негативная селекция (в присутствии 5-фтороротовой кислоты клетки 6%АЗ' погибают). Извесгны пять типов дрожжевых векторов; их сравнительные характеристики представлены в табл. 1!.2.
Векторы типа Ир (уеаги )пгеягатйтя р(аяшс1) являются фактически бактериальными век"горами„так как дрожжевая ДНК в них представлена только одним из указанных в табл. 1!.! генов. ЕсоИ ! б1 в 'апв И хы1 в еж Яа!! хьы Рис. 11.1. Строение кольпевых дрожжевых векторов У!р (а), УЕр13 (б), Уйр17 (е) и УСр50 (г). Указаны единственные сайты рестрикции для распространенных рестриктаз Глава 11. Дрожжи 355 Они, естественно, не способны реплицироваться в дрожжевых клетках, но осуществляют их трансформапию путем интеграции в хромосому через рекомбинацию дрожжевого гена с гомоло>ичным участком хромосомы (в результате образун>тся >етерозиготы по этому гену; трансформанты нестабильны) и пугем замены хромосомного гена на векторный с помощью двойного кроссинговера (конверсия гена; трансформанты стабильны).
Первый вектор типа Ъ'!р был сконструирован с использованием плазмиды Со!Е! (см. рис. 3.12) и маркера ЕЕИ (Н 1ппеп ег а!., 1978). В качеел не примера представлен вектор У!р5 (рис. ! 1.1,а; 81г»1>! е> а1., 1979). Вектпры типа УЕр (уеаз1 ер>вота! р!азт(г)) состоят из плазмиды рВК322, репликатора 2-микронной плазмиды и дрожжевого селективного маркера. Минимально необходимыми элементами, требуклцимися для автономного поддержания вектора в дрожжах, являются сайты пп и ЮТВ 2-микронной плазмиды„ поскольку белки, работа>ощие в этих сантах, поставляк>тся ьч >галя клеткой и присутствующими в ней плазмидами.
Как уже говорилось, сайт ЗТВ обеспечивает распределение плазмидных ДНК по дочерним клеткам (см. гл. 3), поэтому векторы типа т'Ер относительно стабильны. Первый такой вектор представлял собой плазмиду рМВ9 (см. рис. 7.2) с встроенной 2-микронной ДНК и маркером ЕЕИ (Ве88з, 1978). На рис. 11.1,6 представлена схема вектора ЪЕр13, сконструнрованно> о на базе плазмиды рВВ322, 2-микронной ДНК и лрожжевого маркера ЕЕИ (Вгоасй ег а!., 1979). Высокая эффективность трансформации дрожжей этим вектором (около 1О" колоний на 1 мкг ДНК на 10> клеток) позволила с его помощью создать банк дрожжевых генов. Клонирование осуществляли через ВатН!-сайт, расположенный в гене Тгв .
Трансформанты отбирали среди клеток Г,. гпВ по признаку Ар", а клоны с рекДНК отыскивали по чувствительности клеток к тетрациклину. Векторы типа И~В (уеаз! гер!1сайп8 р(аа>пЫ) имен>т хромосомные репликаторы АВХ Первый такой вектор был получен случайно в процессе конструирования вектора У!р, содержащего маркер ТВР1. Он приобрел способность к автономной репликации, что и позволило выявить первый АЮ'(81гцЫ ег а1, 1979). Эти векторы нестабильны и применяются в случаях, когда 356 Часть И1.
9кспрвссин «вдквродных аннов появляется необходимость иметь умеренное число копий клопируемого 1ена. В качестве примера представлен вектор г'Кр17 (рис. 11.1,ы; В!го)1! е! а!.. 1979). 2)екторы типа УСр (уеагя сеп1гогоеге р1азпйд) кроме хромосомных ренликаторов содержат центромеры дрожжевых хромосом (см. гл.
5). Первая центромера (С87»3) была найдена путем клонирования в векторе Ъ'Вр фрагментов ДНК третьей хромосомы, прилежащих к пентромерной области, и поиска стабильной рекДНК (С1агке, СзгЬоп, 1980). К настоящему времени выявлены центромеры всех хромосом, и все они оказались взаимозаменяемыми. Поскольку, как известно, центромера обеспечивает физическукв связь хромосомы с нитями веретена, векторы тина УСр проявляют стабильность при митозе и мейозе, хотя и в тысячу раз меньшую, чем естественные хромосомы, которые при митозе теряются с частотой около 10 '. Кроме того, в процессе мейозз векторы УСр сегрегируют цо Менделю и имеют низкое число копий.
Дру~ ими словами, они фактически представлякгг собой кольпевые мини-хромосомы. С помщцью одной из пих, 1'Ср50 (рис. 11.!,г), был сконструирован геномный банк о. сегеияае (Вове ег а(., ! 987). Векторы тала Ир (усач! Впезг р)ззппг)). Первые линейные плазмиды такого типа были получены из векторов Ъ'Кр (Ввоз!ай, В(зскЬцгп, 1982) и УСр (Моггау, Яков!ах, 1983) ну|ем их линеаризации и присоединения к образовавшимся концам теломер (см.
гл. 5), взятых из внехромосомной линейной рДНК ресничной инфузории Ттга(|утсла. В дальнейшем зти плазмиды (рис. 1!.2,а) использовали для клонирования дрожжевых теломер и анализа их структуры. ТЕГ. ТР.Р АЯВ а) «фри Вф» ТЬР ТН. ТЗР АЯЗ СЕН ТН. «фввг .. -. -.... кв Фиф» ТАс Рис. 11,2. Принципиальные схемы линейных дрожжевых векторов И.р (а) и УЛС (о) Глава 11. Дрожжи 357 Векторы типа К4С (усам агт(!1с!а( спгошовоп1е). К таковым относятся те из векторов У) р„которые содержат все структурные элементы дрожжевых хромосом — реиликатор, центромеру и теломеры (рис.
1! .2,6). Линейные плазмиды данного типа с размером < 20 т.п.н. митотически менее стабильны, чем кольцевые плазмииы того же генотипа. Олнако с увеличением ллины их стабилыюсть существенно повышается (Мштау, Ввоз!ак, 1983), гго привело к идее использовать их лля клонирования больших фрагментов ДН К. К4С-клонирование. В основе УАС-ююнирования лежит возможность использовать клетки Е соВ для накопления векторной ДНК в кольпевой форме и поддерживать рекДНК в дрожжах в линейной форме (Вигке ег а!., !987).
Уже первая такая илазмила, рУАС2, содержала все необходимые для этого генетические элементы (рис. 113): репликатор и селективный маркер плазмилы рВК322, фрагмент дрожжевой хромосомы 1У, вклк~чаюгций расположенные рядом покусы ТВР! -АВ51-СЕ(У4, а также дрожжевые селективные маркеры (%43, 5ВР4 и О(53. Последний маркерный ген был фланкироваи Ваго!11-сайтами и инвертированными тсломерными локусами, взятыми из рДН К Тепгайутепа. Ранее было выяснено, что образовавшиеся в результате расщепления этой рестриктазой концевые ТЕХ-покусы восстанавливаются !и ияо до функциональных теломер. В гене 5ЬР4 находился клонирующий 5та1-сайт; са(угы Щ и Мог) около него предназначались для вырезания вставок.
Процедура клонирования заключается в следующем. Векторную ДНК обрабатывают рестриктазами ВатН( и 5та1, по приводит к образованию трех фрагментов: лва из ннх послужат плечами будущей хромосомы, а фрагмент с геном ВТ53 отбрасывают. Плечевые фрагменты дефосфорилируют щелочной фосфатазой и лигирук>т с фрагментами геномной ДНК, полученными в результате ее частичного гидролиза рестриктазами, которые совместимы с Яма(-сайтоьь (Векторы рУАС4 и рЪАС5 имеют в гене 5(7Р4 более удобные для клонирования сайты — ЕсоК! и 7уог( соответственно). Далее дрожжи трансформируют, причем первичный отбор дрожжевых траисформантов ведут по маркеру 353 Часть 111.
Экспрессия чужеродных гение АЛВ1 оа! в' и 1еломааа ДНК База! ВалзГН ~ щелачааа фоефззаза в аг Блч ДНК-ллеаза влч Рис. 1!.3. Конструирование искусственной дрожжевой хромосомы уАС2. 3/1Ч вЂ” сайты для рестриктаз фЛ и !уо!! СКАЗ, а затем их тестиругот на присутствие маркера ТЯР1. Это гарантирует наличие в рекомбинанте обоих плеч. Одновременно по цвету колоний трансформантов провергпот эффект действия маркера о И'4. Этот ген супрессирует АггЮ-ос11ге мугациго в клетке-хозяине, придавая колониям белый цвет.
Внедрение чужДНК в ген инакгивируст его, меняя цвет колоний на красный. Эффективность ЪАС-клонирования стгражена в табл. 11.2. 1лава 11. Дюжж«359 Высокомолекулярную гсномную ДНК получают, рестрицируют и фракциониру<от в 1%-пой агарозе. Средний размер вставки в геномных тАС-банках зависит от сгспени фракционирования: при использовании нефракционированной ДНК эта величина составляет 120 т.п.н., при фракционировании фрагментов длиной более 100 или 200 т.п.п. — 220 и 370 т.п.н., соотвстствеш<о.
Это позволяет ограничить число клонов в банкс несколькими десятками тысяч (см. табл. 9.1), для чего лостаточно приблизительно 100 мкг геноьпюй ДНК. К сожалению, <и 40 до 60% клонов являкпся химерными (мозаичдыми), т. с. в них всгавки состоят из несмежных фрагментов ДНК, что серьезно осложняет анализ гсномов. Этот эффект вызывается внугримолскулярной рскомбинаписй ьл иго и соединением разных фрагь<ентов ДНК при лигировапии <л я<<го.
Первую причину улается устранить, применяя дрожжевой штамм с дефектом по рекомбинации. Вторая причи«а просто отсутствует при ТАК-клонировании. ТЛ1<-клопир«валле. В методе ТАК (<гапаГоппа<(оп азгос1а<с<1 гссошЬ<пабоп) объединение клонирусмой ДНК с <АС-вектором происходит гл ииз за счет рекомбинапиопной системы клетки, что позволяет обходиться без операции лигирования <л г<гго Известно, что в ДНК зукариот имеются мн<почислснпыс повторяющиеся последовательности.
Например, ДНК человека в среднем через каждые 4 т.п.н. содержит Л!и-повторы (около 300 п.н.), и повторы МЕВ или П(ЧЕК (около 5 т.п.н.) встречаются примерно через 100 т.п.н. Авторы метода (Еаг(оп<в ег а1., 1996 а, Ь) воспользовались этим обстоятельством и ввели такие повторы в концы линеаризованных гАС-векторов. Совместная трансформация дрожжей гсномной и векторной ДНК в результате рекомбинации по этим п<гвторам приводит к образова«ию <ЛС. Конечно, при ТАК-клонировании векторы высокоспециализировапы, поскольку они предназначаются для работы с ДНК только определенного вида. Векторы лля клонирования ДНК человека кроме стандар и <ых элементов ( ТЕЛ, А)<Я, СЕЛ<„маркеры) содержат повторы А!и, МЕК или Е1)чу в любой комбинации. Клонирование выполняется в двух вариантах — с образованием линейных или кольцевых <АС (рис.
![](https://s.studizba.com/z.php?f=/templates/si/i/noavatar.png&w=100&h=100&t=1"){kind=avatar}
