Рыбчин - Основы генетической инженерии - 2002 (947310), страница 71
Текст из файла (страница 71)
Достигнута экспрессия и многих животных генов, поставленных, конечно, под промоторь! грибов. Обычно использукп промоторы индупибсльных генов глюкоамилазы А, а! ан5ог!' и А. п5яег, алкогольдегилрогсназы и ацетамидазы А. и!5)и1плз, цсллобиогидролазь! 1 Т. Т5пг)ае и 7. геехеб Цельк! таких экспериментов является конструирование промышлсгп!ых продуцентов. Например, для полу !ения химозина теленка, применяемого в приготовлении сыров, использовали клетки Е. сой и Х гегвг5яие, в которых экспрессировали к1!НК гена прохимозина, но в обоих случаях секреция белка была низкой, а основная его доля находилась в нерастворимой форме внутри клеток. В то жс время при экспрессии в 'Х: гсетв! кДНК топ! жс гена, поставленного под промотор и сигнальную последовательность !зБ) гена СЬ)51 цсллобиопщролазы 1, основ!еда доля фсрмснтативной актзпиюсти обнаруживалось в культуральной срсдс !Наг)!)!1 ег аУ., !989).
Сам прохимозип нс активен„но при кислых рН он подвергается аугокаталитичсскому процсссингу, превращаясь в химозин. Любопытно отметить, что генно-инженерный химозип, как и природный, оказался нсгликозилированным. Интегративный вектор рАМН104 !рис. 11.10), использованный в этОм экспсримснтс, является типичнОЙ конструкцисй дл5! мицсляльпых грибов. Исаевой ген гюставлсн между ВВ-последовательностью и тсрми!щтором транскриппии гена с!5Н. Эта экспрсссирук5щая кассета и селективный маркер ато5 из А. тг)и)пла вставлены в плазмиду р13С19 для облегчения манипуляций в Е. сей. В клетках У: гееге!'вектор рАМН104 интегрирустся в хромосому через ген гйг1, поэтому трансформанты нс синтезируют цсллобиогидролазу 1.
1см не менее выход химозина был более чем на два порядка хуже, чем цсллобиогидролазы 1 в исходных клетках. Конечно, система далека от оптимальности, что объясняется слабой изучсь!постыл молекулярной генетики !рибов. Глава 11. Ддоэсави 37! Рис. 11.10. Вектор рАМН104, использованный для синтеза и секреции химозина теленка в клепсах Т. геехей р, БВ и рА — соответственно промотор, сигнальная последовательность и сайт полиаленнлнрова~ щя гена сЬл! целлобиоп|дролазы 1; атгБ — селективный маркер. ! ел срохпмозяя» аида ВОПРОСЫ ДЛЯ ПОВТОРЕНИЯ И ОБСУЖДЕНИЯ 1!.!. Какие бактериальные селективпые маркеры используют в дрожжевых системах клонирования? !1.2.
Как вводят трансФормирующую ДНК в дрожжевые клетки? 11.3. Какие элементы 2-микронной плазмиды используют в дрожжевых векзорах? 11.4. Дрожхсевые промоторы зачастую функциональны в Е. соП, а бактсриальные промоторы в дрожжах — нет. В чем может быть причина? 11.5. Охарактеризуйте области применения дрожжевых векторов различного типа. ! 1.6. Для какой цели используют трап спозонные векторы дрожжей? 1!.7.
Предложите консзрукпию экспрсссионного дрожзхево! о вектора, обеспечивающего секрецию чужеродного белка. 1!.8. Составьте план эксперимента по получению банка генов с помощью вектора рУАС4. !!.9. Составьте план эксперимента по выделению определенного гена из плюмпой ДНК с помощью ТАЯ-вектора. !1.10. Какие подходы используют при конструировании векторов лля работы с мицеляльными грибами? Глава 12 РАСТЕНИЯ До сих пор рассматривались проблемы внесения новой генетической инфорлшции в одноклето шые организмы, В таких слу иях внедрение чужеродного гена в одну клсгку и ес последующее клонирование является рутинной операцией.
А как клонировать многоклсточные организмы, состоящие из высокоспепиализированных клаок, особенно высшие растения и животных? Ведь возможности манипуляпий )л хйго с зародышсвьсми клетками крайне ограничены. Своими успехами генетическая инженерия растений обязана в первую очередь достижениям клеточной инженерии (см. гл. 5) в разработке методов регенерации целых растений из единичных дифференцированных клеток или их протопластов. Второй слагающей успеха явилось использование природной системы трансформации растений Т1-плазмидами Адгобасгегшт пале~ос(ет (см. гл.
3) и создание на их базе векторов, способных интегрироваться в растительные хромосомы. Это дало возможность в~юлить в клетки растений чужсролныс гены и получать из елинственной клетки сформировавшееся растение. Такие организмы, в которых чужеродные гены обнаруживаются во всех с~о клетках, включая половыс, называют трансгенными. Они обладают свойством передавать приданные им новые признаки с~юсму потомству. Успех в манипулировании генами достигнут главным образом в работах с двулольными растениями семейства Ло(апасеае, а модельными объектами являются табак, томаты и петуния ("1 синая инженерия растений.
Лабораторное руковолство", 1991). У однодольных, а к ним относятся и зерновые культуры, основная проблема связана с поиском условий их регенерации из изолированных клеток. Успех здесь сопутствовал лишь опытам с ри- Гяавв 12. Рос!левая 373 сом и кукурузой, да н то лишь в релких случаях рсгенерировав- шие растения были плодовитыми. Векторы Т-ДНА' Л-нлазмид !гик природные векторы. Клк уже отмечалось (см. гл. 3), в естественных условиях двудольныс растения подвергаются трансформации Т!- и Н!-плазмидалги агробактерий.
Трансформированные Т1-плазмилами клетки становятся опухолевыми и образуют корончатые галлы (сл!. гл, 5). В изолированном Вила '!акис к'!етки разы!!Ожак)тся без фитого)!монов, синтезируя опипы, а в случае их прививки на здоровыс растения также образуют корончатые галлы.
»'ч — — »,' »,!- — л ч — 'ч а) $» З 2 ! д Вв ВЬ З ф) »+!ч — »,'-- »,'— »+ - ,'ч— ~»5 7 2 ! 4 ба бь 3 б) Т Рис. 12.!. Генетические карты и характертранскрипцииТДНК Т!-олазмнд .1. гите~ас!елгс а — Т-ДНК нопалиновой плазмилы рТ)С58; б — Т, -ДНК и Т„- ДНК октопнповой плазмнды рТ)Ас!!5. Сзрелками указаны направления считывания генов. Знаю! 1 в дуплексе обозначают прямые концевые повторы Т-ДНК. Цифрами обозначены гепы Инфекционное начало содержится в Т-ДНК Т!-плазмид.
Генетические карты Т-ДНК и характер транскрипции ес геков в растительных клеткчх схолны у нопалиновой и октопиновой плазмид !рис. 12.!). Т-ДНК состоят из гомологичных локусов олс, обеспечива!ощих признак онкогенности, и !.снов оса или поз, кодируюших окгопинсинтстазу или нопалинсинтетазу соответственно. Локус олс включает в себя шесть епов.
Продукты генов 1 и 2 преврашают триптофан в индолуксусную кислоту (ауксин, 374 Часть !1!. Эненреееин чужеродных генов см. рис. 55), а изопснтилтрансфсраза, кодирусмая геном 4, синтсзируст один из вариантов питокинина. 13ьюокий впутриклсточный уровень этих фитогормонов приводит к повышсцной митотичсской активности >рансформированных клеток и, как следствие, к образованию опухоли. Свой вклад в лсдиффсрснцировку клоп>к вносят га>окс продукты генов 5, 6а и 6Л. Фенотип каллуса, полученного из трансформированных клсток, зависит от мутаций в гснах олс. Мутации в гонах ! и 2 приводят к формированию побегов, мутации в гснс 4 обусловливак>т развитие корнсй, мутации в генах 6а и 6Л приводят к увсличснию размсра каллуса.
Отсюда происходят и названия групп этих генов — гтз, гл>г и лл>7 (гвп>оцг гпогр(>о1ояу з(>оо!у, гоогу и 1агяс, соотвстствс ни о). В опухолсвых клетках Т-ДНК интегрированы в разных, прсимущсствснно активно транскрибирусмых участках ядерной ДНК, но сайты интсграпии нсспецифичны по о>тюшсцик> к пуклсотидным послсдоватсльпостям. Нопалиновыс и ок>п>пиповыс Т-ДНК в гсномс расппсльных клеток устроены по-разному. Нопалиновая Т-ДНК в раститслык>м гсномс прсдставляст собой нспрсрывнук> послсловательность нуклсотидов (23 т.п.н.), причем имссгся несколько сс копий.
Октопиновая Т-ДНК состт>ит из ссгмснтов Т, (13,6 т.п.н.; одна копия на 1 >сном) и Т (6 — 7 т.п.нл 15 — 30 копий на геном). Первый ссгмснт, содержащий локус опс и ген осе, присутствует обязатсльно, а второй сспчсн г с гс>я>м ляг, которь>й кодируст агропи нси> ггетазу, может отсутствовать. Т-ДНК Фактически являются природными экспрсссионными векторами. Они стабильно поддерживаются в рециписнтных клетках, псрсносят в них чужсроднук> ДНК, которая транскрибирустся с образованием функционально активных бслков, а сслсктивным маркером служит признак онкогенности трансформированных клеток.
Гсны, управляющие псрсносом Т-ДНК, лежат внс сс (в угг-области Т)-плазмид), а структурными элсмснтами, необходимыми для псрсноса, служат сс прямые концевые повторы. Поэтому, как было показано в пионерских работах лаборатории Дж. Шелла в начале 80-х годов, после дслстирования центральной части Т-ДНК послсдняя сохраняст способность к псрсносу. Одновременно дслсгированис центральной части пре- Глава 12. Раегаелка 375 дотвращаст образование опухолсродыых клеток, что важно, поскольку из таких трансформированных клеток нельзя получать целые растения. В этих опытах из клеток табака, трансформированных мутантной октопиновой плазмидой, была полу гена каллусная ткань, из которой с применением фитогормонов по стандартной методике (см. с.
![](https://s.studizba.com/z.php?f=/templates/si/i/noavatar.png&w=100&h=100&t=1"){kind=avatar}
