Рыбчин - Основы генетической инженерии - 2002 (947310), страница 75
Текст из файла (страница 75)
Клетки 86Рт(Т ' человека были трансх)юрмированы препаратом ДНК человека, выделенным из клеток ликого типа, а редкие НИ%7"-зрансг)юрманты были отобраны на срелс НАТ (см. гл. 5). Метод оказался применимым и дтя трансфскции клеток вирусной ДНК (Огайаш, уап дег ЕЬ, 1973), причем в лучших вариантах до 20 % обработанных клеток поглошают ДНК (С1пц ВЬагр, 1981). Трансформируюшая ДНК должна иметь селективный маркер, при юм ДНК, содсржашая селективный ген, может быть физически не связана с исслелусмой ДНК (%®!сг ег а!., !979).
При оптимальном соотношении кшгцсптраций кальция (125 мМ) и ДНК (5 — 30 мкг/мл) их соосаждснис фосфатом нрн рН7 происходит за 20 — 30 мин. Если концентрация исследуемой ДНК невелика, то се общее солержанис до~юлят ло рекомендуемой величи~ ны добавлением любой дешевой инертной ДНК (ДНК-носителя). Полученную суспензгно наносят поверх монослоя клеток или вносят в нее клетки, культивирусмые в жидкой среде.
В течение 16 — 24 ч при 37 "С в атмосфере 5-7 % СО, грапулы осадка путем 392 Часть Ш. Знсдрессня чужеродных генон эндоцитоза поглоша!отса клеткой, после чего суспензию удаля!Ог отмыванием и клетки дополнительно культивируют 50 — бО ч. За это время трансформирующая ДНК локализуется в клеточном ялре в вилс высокомолску1шрных соединении, в которых кОвалснт»о саязш1ы в различных комби!шциях исследуемые и сслсктивные гены с фрагментами ДНК-носителя, Такие молекулы называют трансге!юму!ми. 1 раис!))Ормант мОжст содержать несколько разли шых трансгеномов размером ло ми!и!Иона пар нуклеотидов. Трансгеномы вначале сушествуют отдельно от клеточных хромосом, обусловливая тем самым нестабильность ~рансформантоа.
Гены трансгепомов могут кратковременно экспрессироваться, что может быть зафиксировано по появлению специфических РНК или белков (см. приложение). Иногда один из трансгепомов интегрируется в клеточный геном, образуя лостаточно стабильные трансформанты (селективный маркер теряется с частотой около 1О' па !операцию).
Такис тра! юформанты выявля!от путем рассела обработа1шых трипсицом клеток па селективные среды (около 10' клеток на чашку). Через 2 — 3 нслели на чашках появляются колонии трансформантов. Среди пих более половины приходится на клетки, нссушис од! юврсмспно с сслсктивным геном песелсктивный (исследуемый). В стабильных трансформантах, полученных после обработки клеток чисп !Ми плазмидами (без ДНК-носителя), плазмилная ДНК обнаруживается в ю1сточном гспоме обычно в сдини 1- цых копиях в нескольких различных сайтах.
Динеаризация плазмид рсстриктазами увеличивает вероятность их интеграции и конкатемеризации, поскольку линейные ДНК явлгпотся лучшими субстратами для ферментов, ведущих рскомбинаци!о. ДЕ4Е-декстраловый мепвд. Присугствис поликатиона диэгиламипоэтил-дексграна в среде (около 1 ч при концентрации 1 мг/мл или около 8 ч при концентрации 0,25 мг/мл) способствует какимто образом эндоцитозу ДНК животной клеткой. Метод отличается от предыдушсго тремя важными аспектами. Во-первых, его применяют только для временной экспрессии клонироваш!ых генов (стабильной трансформации достичь не удается). Во-вторых, для трансформапии используют только небольшие количества ДНК (несколько сотен нанограммов), так как большие ко- Глава 13.
Животнь~е 393 личества (болес 2 — 3 мкг) се ингибируют. В-третьих, метов эффективен лишь для небольшого круга клеточных линий, для большинства клеток полимер токсичси. Микроииьекция ДИК о ядра (Сарсссй(, 1980). Микроииъскцию осуществляют пол микроскопом с помошью мнкрокапиллярной пипетки (внешний диаметр около ! мкм, внутренний около 0,5 мкм), Вводимый раствор солерхоп 10' — ! 04 мстлекул траисформируюшсй ДНК.
Объем его ие превышает нескольких пиколитров. Высокая частота получения стабильных траисформаитов, лостигаемая при микроииъскиии ДНК в ядра животных клеток (около 20%), позволяет использовать данный метод даже для случаев, когда в трансформирующей ДНК иет сслсктивных маркеров. В опытах ио совместной микроииъскции Двух плазмил рВВ322 с разными вставками было показано, что котрансформируюшие плазмилы образу!от в клетке мультнмериыс трансгеиомы, которые ингсгрируются в клеточные хромосомы (Апдегьсп ес а1., 1980). Отметим кстати, что эффективность метода микроинъскции была впервые продемонстриронаиа на ооцитах лягушки, которые экспрсссировали ввелеиную в иих мРНК глобина кролика (Оцгс1оп ег а!., !97!).
Оопиты лягушки являются простейиссй системой, позволяюшсй н прслна1>ителы~ьсх экспсрилсеитах тестировать мРНК и ДНК растении и животных иа их способность к экспрессии. Заекгярояораяия. Короткий высоковольтный импульс, приложенный к клеткам животных, вызывает в их мембранах образование пор наиометровон~ размера ()л1еснпапп ег а7., 1982). Если в суспеизии клеток, иаходяшихся в солсвом буфере, ирисугствует ДНК н коипеитраиии ! — 40 мкг/мл, то оиа оказывается внутри клеток. Этому способствует, по-видилсому, каким-то образолс движение слоев мембраны ири "'зазягиваиии*' пор.
Мстол эффективен и для опытов по кратковременной экспрессии клонироваииых генон и лля получения стабильных траисформаитов. Условия эффективной электропорации различны ллл разных линий клеток, поэтому их слслует подбирать в предварительных экспериментах. В срелнсм величина электричсского поля — 250 — 750 В/см, 394 Часть Ш Экспрессия ауясерсдиых геисв ллителыюсть импульса равняется 20--1ОО мс. В этих условиях выживает 20 — 50% популяции клеток. Се!!я!!ив првтопластов. Метод используют лля нспосрслственного переноса плазмил из бактерий в клетки !кивотных (Всйайпег, 1980). В присутствии полиэтилснгликоля бактериальные протопласты наносят поверх монослоя клеток или смешивают с клетками, культивирусмыми в жидкой срелс. После слияния протопластов с животными клетками через 40 — бО ч при 37 "С плазмилы оказываются в ялрс клеток.
Метод эффективен и лля опытов по временной экспрессии клонированных генов, и для получения стабильных трансформантов. При соотношении бактсриальных протопластов к животным клеткам как !0000:1 временная экспрессия наблюдается в 100% клеток, а выход стабильных трансформантов лостигаст 10 '. Схолные оперся!ии Осу!Нсствляют при слиянии лиг!псом, содержащих ДНК или РНК, с животными клетками. Таким путем улалось ввести в раковь!е клетки простаты человека рсхДНК„зкспрессируюшую человеческий ген пнтерлейкина-2 !'!г!е!яек е! гг!., 1994). ВЕКТОРЫ Вирусные векторы Ялерные плазмилы у высцзих эукариог пока нс описаны, поэтому естсствсш!ыми кандидатами на роль "доноров" своих рспликаторов для конструируемых векторов животных являются вирусы.
Хотя сами вирусы облалают эФФективным приролным способом вволить свою ДНК !РНК) в клетку и реплицировап се в большом числе копий, но в исслеловательских целях из-за ряда недостатков вирусные векторь! использу!от реже, чем плазмилныс. Во-первых, в гсномс большинства изученных вирусов отсутствуют нссушсствснпыс лгн! их развития области, которые можно было бы заменить ююнирусмой ДН К. Поэтому векторы, сконструированные на базе таких вирусов, дефектны. Вслслствие этого для работы с ними нужны вирусы-помо!пинки или специальные клетки-хозяева, солсржашис в гсномс необходимую лля вируса дополнительную информацию.
Во-вторых, емкость вирусных векторов ограниче! !а, так как в вирусный капсил может Глава ! 3. Жвеотлые 395 упаковатъся лишь определенное коли 1сство ДНК (РНК). Зто весьма серьезное препятствие для клонирования эукариотических генов, так как многие среди них состоят из нескольких десятков тысяч пар пуклеотидов. В-третьих, вирусные векторы реплицируются только в животных клетках, что крайне осложняет конструирование рекДНК, поскольку эти клетки трулно культивируются и медленно размножаются. Особенности вирусных векторов, используемых для генной терапии человека, описаны отдельно (см. с.
422), Первые векторы конструировали па базе ДНК опухолсродных вирусов, так как они обладают природным селективным свойством: транс~)>ормированныс ими клетки заметно отличаются от нормальных. Часто такие вирусы развиваются литически в клетках одного типа, а онкотрансформапии подвсрггпот другие линии клеток. К ниы относится вирус вУ40. Вирус Юг40. В исследованиях по молекулярной генетике животных этот вирус играет такую жс роль, как и фаг ) в бактериальной генетике: он является одновременно и молелыо, и срсдсгвом для анализа гсномов животных. Эта аналогия тем более справедлива, чго ДНК обоих вирусов широко используется в ка~сстве векторов в генетической инженерии.
Вирус ЯЪ'40 развивается в клетках обезьяны, образуя 10' — ! 0' 1астиц на клетку, и клетки при этом гибнут. В то же время при инфицирования перевивасмых клеток некоторых грызунов (мышей, крыс, хомячков и т.п.) развитие этого вируса блокируется на стадии репликации его ДНК. В результате вирусная ДНК интегрируется в хозяйскую ДНК, вызывая геномныс перестройки и клеточную онкотрансформапию (бесконтрольное деление клеток). Отметим сразу, что по этой причине векторы, сконструированные на базе %~40 ДНК, редко используют для интеграции клонируемых генов в клеточные хромосомы, так как при эгом нет уверенности в сохранении структуры этих генов.
![](https://s.studizba.com/z.php?f=/templates/si/i/noavatar.png&w=100&h=100&t=1"){kind=avatar}
