Рыбчин - Основы генетической инженерии - 2002 (947310), страница 78
Текст из файла (страница 78)
В третьем фрагменте (Вап~Н1-ВсЛ, 237 п.н.) на разных нитях расположены сайты полиаденилирования для ранних и поздних РНК. В векторе р8'ч2 клонировали и экспрессировали бактериальные селективцые гены пео и яр! и мышиный ген с(йуг (рис. 13.6,а). Глава 13. Животные 407 ! -ва!д н!ш!гп рА вшпп! см ншдп! рис 13 6. Строение плазмнлных векторов рЯУ2-ар! (а), рМБО (б) и рЕУ-2 (в). рА, и рА, — сайты полиаденилирования, (соответственно вируса оУ40 и гена гормона роста лосося); 1 — малый 1-интрон; ).ТВ ММТт' — терминальный повтор с промотором вируса опухоли молочной железы мыши; МСз — попилинкер, р — промотор гена В-актива карпа.
Незаштрихованная часть — фрагменты плазмилы рВВ322; тройная линия — селективный маркер Кроме Е. сой вектор рЯУ2 реплицируется только в СОЯ-клетках. Модифицированный же вариант этого вектора — рЯУЗ, полученный путем внедрения в него через ВавтН!-сайт ВаглН1-ВяЛ- фрагмента ЯУ40 ДНК, содержа!него информацию о синтезе Т-агп игена„реплицируется в любых клетках обезьяны. Через 70— 90 ч после трансформации клетка накапливает более !О' копий рекомбинантной плазмиды и погибает.
Поэтому эти векторы используют для наблюдения временной экспрессии. Но с частотой около 10-' — !04 можно получать и стабильные трансформацты 408 Часть Ш. Экспрессия нужероднегх генов клеток человека, обезьяны, мыши, хомяка и т.п., при этом плазмиды типа рЯ~ интегрируются в клеточные хромосомы. Плазмиды с клонированными в описанной экспрессионной кассете селективными генами, а также генами-репортерами саг и /их, широко используются в молекулярной биологии животных для решения различных проблем. Однако для обеспечения экспрессии целевого гена нужна дополнительная кассета. В векторе рМЯС такую кассету составляю~ промотор из терминального повтора 1ТК вируса опухоли молочной железы мыши (ММТН), полилинкер, малый 1-интрон и сайт полиаденилирования вируса ЯН40 (рис.
13.6,0). Плазмиды без зукариотическогореиликатора. Замена в плазмидах типа рЯН промотора ЯН40 на промотор вируса саркомы Гауса, расположенного в его 1ТК-повторе, делает экспрессию селектируемых генов в образовавшихся векторах рКЧН-ерГ и рКЯН- лео еще более эффективной. Конечно„эти векторы используют для наблюдения временной экспрессии.
Этой же цели служат и аналогичные векторы серии рГН, предназначенные для экспрессии чужеродных генов в клетках рыб (1.ш е! а!., 1990). Их экспрессионная кассета состоит из промотора, энхансера и интрона гена р-актина карпа и сайта полиаденилирования гена гормона роста лосося (рис. 1З.б,в). Примечательно, что эта кассета работает и в клетках животных.
Реиликатор вируса иалиллолы быка (ЗР)9. Папилломавирусы инфицируют высших позвоночных, включая человека, и вызывают у них появление доброкачественных опухолей эпителия (в том числе бородавок). Вирус папилломы быка, как и все папилломавирусы, не развивается в клеточных культурах, но вызывает онкотрансформацию культивируемых клеток грызунов, в которых вирусная кольцевая ДИК (7954 п.н.) реплицируется и поддерживается в виде мультикопийной плазмиды.
Это свойство позволило создать челночные плазмидные векторы, в которых поздние гены вируса заменены чужеродными. Гекомбинантные векторы могут длительное время поддерживаться в плазмидном состоянии (100 — 200 копий на клетку) или интегрироваться в большом числе копий в клеточную Глава ! 3. Животние 409 хромосому. А это означает, что ВРЧ позволяет создать клеточные линии, постоянно экспрессируюшие чужеродные гены любых размеров. Стандартные селективные маркеры (гк, ерб пео), включенные в векторы, позволяют проводить отбор нужных трансформантов. Столь же стандартны используемые экспрессионные кассеты. Реплинатор вируса Эпштейна — Барр ГБВг7. Этот герпесвирус инфицирует только В-лимфоциты приматов, не вызывая их лизиса.
Некоторые из этих клеток приобретают способность к неограниченному делению, преврашаясь в лимфобласты, в ядре которых вирусная кольцевая ДНК (172 т.п.н.) реплицируется и поддерживается в виде мультикопийной плазмиды. На основе репликатора ЕВЧ создан ряд челночных плазмилных векторов. Современные векторы. Примером могут служить векторы серии рсРХА3.1 (фирма "1пг)ггояеп"), которые содержаг весь необходимый арсенал для поиска необхолимых клонов и очистки продукта (рис. 13.7). Эти челночные векторы поставляются в наборе из трех плазмид для выбора правильной рамки считывания.
Они имеют по две экспрессионные кассеты, одну тщя выражения селективного маркера (промотор и сайт полиаденилирования вируса ЯЧ40) и вторую для получения целевого белка (промотор цитомегаловируса, СМЧ, и сайт полиаденилирования гена гормона роста быка, ВС Н). Во второй кассете находится локус, кодирующий вспомогательную часть гибридного белка (см. гл. 1О), которая обеспечивает возможность его очистки (Н)з,), маркирования целевого белка (эпигона Ер() и отщепления целевого белка от гибридного (ЕК-сайт). Вслед за покусом (в других вариантах — перед ним) расположен полилинкер МСЯ, который после внедрения в него целевого гена обусловливает Х- или С-концевое расположение вспомогательной части гибридного белка.
Полученный гибридный белок затем афинно очищают и обрабатывают энтерокиназой для получения целевого продукта. При необходимости внелренный ген может быть транскрибирован т гггго РНК-полимеразой фага Т7, для чего имеется соответствующий промотор. 410 Часть П!. Зкслрессия «ужвродвнх генов Ртт АТО Н)ав Ер) МСВ Рис. 13.7.
Строение плазмидиых векторов серии рс13)ЧА3.1. Знак С в дуплексе —. инициирующий кодов для синтеза гибридного белка Алов Ара и ау40 атча ВВЕДЕНИЕ ГЕНОВ В ЗАРОДЬППЕВЫЕ КЛЕТКИ И ПОЛУЧЕНИЕ ТРАНСГЕННЫХ ЖИВОТНЫХ Разработка методов введения генов в зародышевьге клетки млекопитающих является крупнейшим достижением современной биологии. Получаемые при этом трансгенные животные дают возможность изучать регуляцию генов в процессе эмбриогенеза и дифференцировки, исследовать действие онкогенов, наблюдать взаимодействие клеток при формировании иммунной системы и т.д.
Само животное представляет собой одновременно экспериментальную систему для выявления эффекта клоннрованных генов, модель для исследования генетических болезней человека и источник полезных (но чуждых для него) белков. Основой успехов стала возможность кратковременного манипулирования и иуго с зародышевыми клетками животных. Это позволяет инъецировать в них ДНК, инфицировать их ретровирусами, замещать ядра, а для получения химер смешивать с клетками других эмбрионов или с плюрипотентными стволовыми клетками (рис. 13.8). Затем их имплантируют в яйце- воды или матки псевдобеременных "приемных" матерей„которые и производят потомство. Глава 13. Живовряые 411 рионвльны 1н трвнсфеызи» цс (Р ство»овне зк и — '." Мнкроиньмсци» Ж (СплалотвсРейнтк Инфещи» 1»ржеквенм ранзнбннанни»м ~ ~ Раннее веление ретроанрусом пр ос ызсзтж Образование 1 рекомбннантным бластоцисты зф' Мнкронньеыиы 11вх Властонигац Рмвитие змбриона Рис.
13.8. Методы получения трансгенных и химерных животных. По 01о, Рппкобе (1994) Микрошпекгбия ДНК. Впервые этот метод был апробирован путем инъекции БУ40 ДНК в бластоцисты мыши ()аеп(всЬ, Мшгх, 1974). Рожденное потомство бьшо, конечно, химерным, т.е. клетки не всех тканей содержали вирусную ДНК, поскольку не все клетки бластоцисты были трансфицированы. Трансгенные мыши были получены, когда ДНК (клонированный провирус Молони) была инъецирована в цитоплазму зиготы (НагЬегз ег а1., 198!). Уже в то время было обнаружено, что характер экспрессии введенных вирусных геномов зависит от места их интеграции в клеточные хромосомы. В одних линиях 412 Часть Ш. Экспрессия яугкероднеое генон трансгенных мышей пролукпия вируса начиналась в клетках печени еше на стадии плода, в других — в селезенке, вскоре после рождения.
Имелись также линии, в которых вирусы не продуцировались совсем, несмотря на присутствие провируса. Подобная временная и тканевая специфичность экспрессии была выявлена и у трансгенных мышей, несущих индивидуальные чужеродные гены (Оогс!оп, Кпс)с)1е, 198!). Эти авторы инъецировали клонированные гены ТК вируса простого герпеса и 13-глобина человека ДНК в мужской пронуклеус (он больше по размеру) только что оплодотворенных т у1Гго яйцеклеток, что оказалось более эффективным способом, чем инъекция в цитоплазму.
Обработанные клетки сначала культивируют !и пгго ло стадии морулы или бластоцисты, а затем имплантируют "приемным'* матерям. До 40 % родившегося потомства является трансгенным. Как показали результаты опытов, интеграция чужДНК происходит в различные сайты разных хромосом, и поэтому нельзя предсказать характер экспрессии чужеролных генов. Однако во многих случаях экспрессией можно управлять, если гены присоединять к индуцибельным промоторам. Так, ген ТК' был поставлен под контроль промотора гена металлотионина-1 (МТ) мыши. Этот белок участвует в регуляции обмена цинка и связывает ионы тяжелых металлов. Поэтому с помощью цинка и кадмия удалось индуцировать экспрессию гена ТК' в разных тканях полученных трансгенных мьппей, причем тканеспецифичносгь экспрессии соответствовала той, которую проявляет сам ген МТ(Вппзгег ег а(., 1981).
![](https://s.studizba.com/z.php?f=/templates/si/i/noavatar.png&w=100&h=100&t=1"){kind=avatar}
