Рыбчин - Основы генетической инженерии - 2002 (947310), страница 81
Текст из файла (страница 81)
рис. 13.4, а), позволяют клонировать ло 8 т.п,н. чужДНК. Полезным свойством таких векторов является полное отсутствие вирусных белков в транслуцированных клетках, и поэтому и у1уо эти клетки не будут восприниматься иммунной системой организма как чужие. Это обстоятельство совместно с фактом, что терапевтический ген интегрируется в клеточную хромосому, обеспечивают стабильность терапевтического эффекта. Однако рет- Глава 13. Животные 423 ровирусы не обладают тканеспецифичностькк и для их доставки в определенный тип клеток необхолимо использовать рецептор- опосредованные способы переноса (см.
с. 428) либо ограничиться методами ех иго. Как известно, эукариотические мРНК моноцистронны. Поэтому„если необхолимо доставить в клетку сразу несколько терапевтических генов, то в вектор приходится встраивать дополнительныс экспрессионные кассеты. Чтобы преололеть эту техническую сложность, предложено использовать особенность пикорнавирусов, облалающих полицистронной матрицей. В их РНК есть внутренние сайты посадки рибосом ИЕВ (1пгегпа1 ИЬозоп1е Еп1гу Баев), позволяющие им инициировать кэп-независимую трансляцию на внутренних инициирующих колонах. Внедрение этих локусов внутрь ретровирусной транскрипционной единицы позволяет организовать экспрессию нескольких генов с олного промотора (Адап1 ег а1., 1991). Конечно, эта возможность ограничена небольшой емкостью ретровирусных векторов (8 т.п.н.).
Олна из важных проблем при использовании ретровирусных векторов для генной терапии — их потенциальная опасность. Во-первых, лефектный сам по себе вектор путем рекомбинации с деФектным провирусом-помощником может образовать инфекционный вирус. Во-вторых, не исключена возможность инактивации существенною клеточного гена в процессе интеграции векторной ДНК в хромосому. В-третьих, препарат рекомбинантного вируса может быть загрязнен сопутствующим вирусом. Адеповирусы человека привлекательны для целей генной терапии из-за своей низкой патогенности, знания его молекулярной биологии, неинтегрируемости его ДНК в клеточную хромосому и возможности получения вируса в высоком титре.
Поскольку они специфичны к клеткам дыхательных путей, то впервые аленовирусные векторы применили лля генной терапии муковисцидоза. Это заболевание распространено особенно в европейской и североамериканской популяциях (3-5 случаев на 10 000 детей). Оно вызвано дефектом гена СГТВ (сузгьс ВЬгоз)з ггапзглеп1Ьгапе сонг)всгапсе гейц)агог), белок которого регулирует водосолевой обмен в эпителиальных клетках. 424 Часть П1. Экснрессин чужеродных генов Нарушение его функции велет к повышенной вязкости секрета бронхо-легочных путей и хронической бактериальной инфекции, что в половине случаев кончается гибелью больного в возрасте до 30 лет.
Дефектный ген рецессивен. Введение в клетку и пгго лаже одной копии нормально~о гена приволит к исправлению дефекта. Олнако клетки эпителия высокодифференцпрованы, крайне медленно делятся, и введенные пациенту модифицированные клетки не восстанавливают эффективно лостаточную площадь в бронхо-легочных путях.
Поэтому был использован аэрозольный метод доставки нормального сена непосрелсгвенно в лыхательные нуги с помощью аденовирусного вектора. Первые клинические испытания (Сгуага! его)., 1994) показали, что введенные гены действительно работают в лыхательном эпителия. Олнако, находясь в ядре и не будучи интегрированными, они постепенно терялись при клеточных делениях. Аденовирусные векторы первого поколения (с делецией локуса Е), см. с. 404) сохранили позднис гены, кодирующие структурные белки. Это является еще олной причиной их нестабильности.
Введенные в организм клетки с вирусными белками воспринимаются как чужеродные и постепенно элиминируются иммунной системой. Эти факты говорят о том, что аденовирусные векторы больше подхолят для терапии рака, тле достаточно временной экспрессии терапевтических генов, чем для исправления наследственных дефектов. Из других вирусов упомянем вирус простого гсрпеса, который потенциально полезен лля генной терапии болезней Паркинсона и Альцгеймера, поскольку он инфицирует нервные клетки и его ДНК не интегрируется в клеточный геном. Изучаются возможности для генной терапии аленоассоциированного вируса (ААЪ"). Этот лефектный вирус размножается только в присутствии аденовируса или вируса простого герпеса, а в отсугствие помощников его ДНК интегрируется в опрелеленный сайт хромосомы 19 человека, позволяя одновременно достигать стабильности введенного гена и избе~ать нежелательных пскледствий из-за непредсказуемости интеграции генов.
Миобласты как кееточоые векторы. Миобласты являются предшественниками клеток скелетных мышц: сливаясь лруг с лру- Глава 13. Животные 425 гом, они образукп мышечные волокна, т. е. многоядерные клетки, содержащие несколько тысяч ядер и длина которых достигает у человека полуметра. Миобласты легко выделяются из мышечной ткани, хорошо выращиваются в культуре, сохраняя при этом способность к дифференцировке. Г)ри инъекции в мышечную ткань они становятся ее интегральной частью, сливаясь с имею1пимися волокнами или образуя новь1е. Стабильная экспрессия введенных (нормальных) генов в ядрах трансплантированных миобластов наблюдается до 6 мес. Таким образом, генная терапия с помощью миобластов пригодна для лечения любых форм мьппечных заболеваний и не требует идентификации дефектного гена.
Впервые она была применена для лечения мышечной дистрофии Дюшенна. Мышечная дистрофия Дюшенна характеризуется отсутствием дистрофнна, что приводит к прогрессирующей дегенерации скелетных и сердечных мышц и гибели на втором десятке жизни. Болезнь затрагивает в среднем одного нз 35ПО мальчиков. Один из возможных подходов к терапии этой болезни — восстановление экспрессии листрофина путем трансплантации миобластов в мышцы. Излечивание может и не наступить, поскольку болезнь затрагивает различные типы мышц„но возможно существенное облегчение. Описан положительный клинический эффект, когда 21 мальчику в возрасте б — 14 лет, имеющим это заболевание, трансплантировали в мышцы нормальные миобласты, взятые от братьев или отца и выращенные в культуре до нужного количества ((ле ег а1., 1992).
В сумме за 48 инъекций было введено 5-10' клеток в разные мышцы обеих нижних конечностей с отчетливым терапевтическим эффектом. В качестве иммунодепрессацта использовался циклоспорин. Заманчивой идеей является генная терапия различных заболеваний путем введения в кровоток клеток. содержащих нужный ген. В экспериментах с мышами были опробованы различные типы культивируемых клеток, но в большинстве случаев клетки или полвергались онкотрансформацни, или синтез продукта быстро прекращался. Только миобласты рассматриваются как потенциальный вектор благодаря их уникальной способности сливаться с мышечными волокнами.
В опытах с мышами введенные в 426 Часть И!. Экспрессия Юокеродных генов кровоток миобласты, содержащие ген гормона роста человека, вошли в состав мышечных тканей и экспрессировали этот ген: гормон определялся в плазме крови около трех месяцев. Подобные результаты позволяют рассматривать возможности использования миобластов для доставки генов, кодирующих другие гормоны, Факторы коагуляции, ростовые Факторы и разные противоопухолевые агенты. Хлетка костного мозга. Эти клетки можно легко выделить, провести с ними манипуляции рв и!!со и реимплантировать тому же пациенту. Костный мозг представляет собой гетерогенную популяцию дифференцированных (эритроциты, лимфоциты и ток) и стволовых клеток.
Последние обеспечивают воспроизведение клеточной популяции костного мозга и поэтому являются главной мишенью операций по генной терапии. Их лола в ткани невелика — не более 0,5% Казалось бы, что генную терапию можно применять, прежде всего, для лечения генетических заболеваний крови, вызывающих появление аномальных гемоглобинов. Однако такая терапия пока недоступна, поскольку еще не изучен механизм регуляции синтеза глобинов, т.
е. пока нельзя осуществить регулируемую экспрессию генов глобина, введенных в клетки костного мозга. Для генной терапии более подходят нерегулируемые, но экспрессирующиеся в клетках костного мозга гены гипоксантингуанинфосфорибозилтрансферазы (Я6РЯТ), пуриннуклеозидтрансфсразы (РМР) и аденозиндеаминазы (АРА), дефектность которых вызывает тяжелые заболевания. Например, аденозиндеамнназа катализирует дезаминирование аденозина и лезоксиаденозина в инозин и дезоксиинозин, соответственно.
При ее отсутствии лезоксиаденозин накапливается в организме до уровня, который токсичен для некоторых типов клеток, в том числе Т-лимфоцитов (инозин нетоксичен). Генетический дефект обычно приводит детей к гибели от инфекционных заболеваний. Первая процедура по генной терапии человека была осуществлена именно с геном АРА (В!аезе, Алс)егаоп, !990). Пациентом была четырехлетняя девочка с дефектом по этому гену.
Из ее крови были выделены лимфопиты, которые затем выращивали в лаборатории в условиях, способствующих предпочтительному де- Глава 13. Животные 427 ленив Т-лимфоцитов. Далее Т-лимфоциты были инфицированы ретровирусным вектором, несущим гены АЙА с промотором ЕТВ и лса с промотором ВЧ40. Рекомбинантные клетки вырастили ло общего количества в несколько миллиардов и ввели в кровь пациентке. Эффект был положительным. Общее число лимфопитов поднялось ло нормального уровня, а количество аденозиндеаминазы в Т-клетках составило 25 % от нормального содержания. Эти цифры были почти неизменными в течение полугода наблюдения. Геинаа тералиярака. Числа больных с дефектом АЮА невелико, во всем мире их насчитывается несколько сотен.
![](https://s.studizba.com/z.php?f=/templates/si/i/noavatar.png&w=100&h=100&t=1"){kind=avatar}
