Рыбчин - Основы генетической инженерии - 2002 (947310), страница 83
Текст из файла (страница 83)
Поскольку имекпся в виду случаи, когда внесегпгая информация стабильно наследуется и проявляется фенатипическн на уровне организма, та работы по получению соматических гибридных клеток, созданию химерных растений и животных в аспекте геномной инженерии рассматриваатся лишь как этапные или модельные эксперименты. Ряд таких экспериментов рассмспрен в гл. 5. Целенаправленное конструирование новсях гецомав требует знания их структуры, понимания принципов их организации, а также учета механизмов взаимодействия генов и их продуктов. В свою очередь одним из методов исследования этих аспектов может служить геномная инженерия. Природе также не чужда стратегия геномного конструирования.
Так, результатом природной геномной инженерии вирусов, вызывающих грипп, являются его сильные эпидемии„происходящие приблизительно каждые восемь лет. Дело в том, что геном этих вирусов состоит из восьми различных фрагментов РНК. со- Глава 14. Геномная инжененин ЛЗЗ держащих по одному гену. При совместном внутриклеточном развитии вирусы могут обмениваться сходными фрагментами. Если этот обмен совершается между вирусами гриппа человека и животных, то возникают вирусы с новой антигенной структурой, обусловливающей распространение эпидемии. Принципы геиомпого конструирования В настоящее время геномная инженерия находится в стадии накопления экспериментального материала.
Тем не менее на основе достижений молекулярной биологии и генетики можно сформулировать некоторые общие принципы геномного конструирования, которые справедливы, по крайней мере, для плазмид, вирусов и одноклеточных организмов. Все гены организма можно разделить на облигатные и факультативные, т. е. на обязательные и необязательные для выживания организма в заданных условиях (или воспроизводства плазмид и вирусов в клетке). Чтобы продукт геномной инженерии был жизнеспособным, его геном должен содержать все облигатные гены.
Большинство генов в геноме включено в те или иные регуляторные цепи. Рееуляторные механизмы обусловливают поддержание концентрации клеточных продуктов (как в количественном, так и в качественном отношении) на определенном уровне, зависящем от внешних условий (сигналов). Между частями гибридного генома, произошедшими от разных доноров, регуляторные связи в той или иной степени нарушены. Для их восстановления необходимо в определенные гены вводить мутации, создавать новые сайты рецепции ре1уляторных сигналов, изменять мощность или специфичность некоторых промоторов и т.п. Следовательно, регуляторные связи между совмещенными в гибридном геноме генами должны быть взаимно согласованы.
Каждый из белков в процессе выполнения своей функции взаимодействует со многими другими белками. Если он является функционально гомологичным, но чужеродным для данной клетки, то это взаимодействие может быть в различной степени специфичным. Слабую видовую специфичность проявляют, например, 434 Часть!П. Экспрессия чужеродных генов рибосомные белки разных видов кишечных бактерий. Из них можно собрать функционально активнчяе гибридные рибосомы. Высокую видовую специфичность проявляют многие гормоны животных, интерфероны и т.п.
Они не функционируют в организмах "чужих*'видов. Такимобразом,между взаимодействующими чужеродными друг для друга белками должно быть структурное соответствие, обеспечиваюшее выполнение ими совместно определенной функции. Простейшими образцами геномного конструирования являются работы гю созданию векторов 1см. гл. 7, 10 — 13). В частности, наглядным примером геномной инженерии служат фазмиды, обьединяющие в себе свойства фагов и плазмид. Патент на "изобретение'* фазмид принадлежит природе. К ним относятся умеренные колифаги Р1 и Х15, о которых говорилось в гл. 4.
Их профаги находятся в плазмидном состоянии и подвергаются строгому контролю репликации. Как и другие плазмиды, они обладают свойством несовместимости (см. гл. 3). С другой стороны, будучи профагами, они имеют специфические системы иммунитета. Примерами лабораторных фазмидных конструкций являются векторы ЛрМУГ131 и ЛУАР (см. рис. 7.7). К продуктам геномной инженерии можно отнести также космиды, фагмиды, дрожжевые и другие челночные векторы. Но наиболее последовательное использование принципов геномного конструирования можно проследить на бактериофагах.
Бактериофаги Умеренным фатам свойствен ряд основных признаков — иммунность лизогенных бактерий„специфичность сайта интеграции профага в клеточную хромосому, специфичность к клетке- хозяину, антигенная структура, вирулентность. Изменение хогя бы одного из них дает начало новой разновидности фагов, что можно рассматривать как пример геномной инженерии. Геномное конструирование можно проиллюстрировать на примере гибридов лямбдоидных фатов Л и ФЗО (см. гл. 4). У этих фагов генетические карты сходны ~рис. 14.1), гены, занимаюшие одинаковые места, выполняют аналогичные функции, а геномы обладают тремя характерными особенностями.
Глава !4. Геннмная инженерия 435 ООО ь ! о к! -1- Я, Ь-$ О(!,О ,3! Д аз ! !!~ О'О о !.и ьь ь ОО ОО ОО аО М Ы о$ О ОО Ж й й х о „.й5 ~х~ Д оп ь й- Ф '"оо Х оь ° О о о ь Ы !Д ,О ~,О ~ЫБ ак ы Я Ы Й Ь',ь о о о :Я ! о, о о ж х О' Ой о о В,а $р о ! 436 Часть !В. Экелреесия чужеродльи геков 1.
Гены, отвечаюшие за определенную функцию, сгруппированы вместе (к примеру, гены головки, отростка, рекомбинации, регуляции ранних функций, репликации и лизиса). 2. Почти во всех случаях гены, продукты которых взаимодействуют с фаговой ДНК в определенных сайтах, располагаются рядом с этими сайтами (гены )чи1-А и сов-сайт; 1лг-хЫ и аггсайт; !ч'и сайт терминации транскрипции Л.1; с! и операторы о1 и оК и т.л.; см. рис. 4.1). 3. В большинстве случаев функциональные блоки генов разграничиваются областями физической гомологии.
Эти особенности сушественно облегчают геномное конструирование. Ведь сцепленность генов и сайтов, выполняющих определенную функцию, обеспечивает их совместную передачу в рекомбинационных процессах 1л у!уо и 1и иГго, что важно для их функционирования, поскольку каждый из элементов по отдельности биологически инертен. Наличие областей гомологии между Х и 480 ДНК и сходство их генетических карт позволяют конструировать гибриды с помошью простой рекомбинации ш и во при сохранении в гибридном геноме всех существенных генов (первый принцип). Эти фаги могут обмениваться структурными генами (включая и Ь-признак, определяющий специфичность к клетке-хозяину), блоком интеграционных генов с аи-сайтом, областью иммунитета, а также областью Оол, отвечающей за лизис клетки.
Однако не всегда рекомбинации приводят к образованию жизнеспособных гибридов. Это обьясняется тем, что жизнеспособность фагов определяется не только наличием в геноме всех существенных генов, но и регуляторными взаимоотношениями между ними (второй принцип). Известно, в частности, что продукт гена )ч* осуществляет антитерминирующее действие в сайгак 11.1, 1К! и гК2 и что Х-продукты фагов л. и фЗО взаимно незаменяемы. Поэтому обязательным условием нормального развития Х-~)ЗО гибридов является присутствие в рекомбинантном геноме одновременно гена !ч' и Г-сайтов одного и того же фага. Вот почему гибрид 4ЗОЬу42 с рекомбинацией по гомологичному участку в области гена О, разделяющему сайты Ф! и ГК2, удалось получить только после удаления гК2-сайта с помошью делеции л1л5.
Глава 14. Геномная инженерия 437 Второй принцип лежит также в основе создания гибрида ф80Ьу43. Известно, что мутация е17 у Фага Л, располагающаяся в области у, обеспечивает независимость транскрипции генов О и Р от ГК1-сайта и конститутивность репликации этого фага, что в сочетании с мутацией обусловливает способность фага Лс1с17 размножаться на Л-ьюнолизогенах. Совмещение в одном геноме мутаций ф80с1 и Лс17 при соблюдении отмеченных условий относительно гена 7У позволило сконструировать жизнеспособный гибрид (ф8011у43), вирулентный только для монолизогенных штаммов с профагом ф80.
Рекомендации третьею принципа учесть гораздо сложнее, поскольку отсутствует необходимая информация. Поэтому вопросы структурного соответствия тех или иных белков разных организмов, выполняюгпих совместно олпу Функцию, решаются опытным путем. Предполагалось, например, что эффективный морфогенез фаговых частиц осуществляется лишь в том случае, если все гены и соответственно белки головки, а также отростка принадлежат одному фату. Однако путем рекомбинации Л и ф80 ДНК в некоторых определенных участках структурных генов были получены жизнеспособные гибриды типа ЛЬ80илглЛ. Следовательно, из конкретных комбинаций белков, относящихся к различным фатам, можно собрать и фаговые головки (гибрид Л(7Уи1-Р1пЗО/ттЛ), и отростки (гибрид Л114и1 -Н~л80гттЛ).
При соблюдении принципов геномного конструирования удается получить жизнеспособные гибриды даже между отдменными фагами. Так были выделены гибриды фагов Л и Р22, которые, несмотря на сходство в строении геномов, отличаются следующими свойствами. !. Кольцевая Л ДНК образуется из линейной благодаря наличию на концах последней однонитевых комплементарных последовательностей.
У Р22 ДНК этот процесс идет вследствие рекомбинации между концевыми повторами. 2. Фату Л свойствен длинный отросток с нитью, а у фага Р22 он короткий и имеет базальную пластинку. 3. Лизогения у Фага Л контролируется одной областью иммунитета, у Фага Р22 — двумя. 438 Часть 1П, Зксг1рессня чужеродных генов 4. Фаги имекл различные клетки-хозяева (у Л вЂ” Е. со11, у Р22 — Х гур1г1типит). Указанные различия столь существенны, что в гибридах ни одна функция не оказалась рекомбинантной, наблюдались лишь их комбинации.
Например, у гибридов 1ттМР22 и 1оипР22ЬЛ ранние и поздние функции фагов Л и Р22 сочетаются в любой комбинации. Одноклеточные организмы Современный уровень знания допускает возможность создания клеток новых видов только путем радикапьной модификации избранного родительского типа или путем создания межвидовых гибридов. Согласно принципам геномного конструирования создание жизнеспособных гибридов практически возможно только между эволюционно близкими организмами.
У бактерий первые межвидовые гибриды бьии получены при скрегцивании клеток Е со11 и Х гурЬ1типит. ДНК этих организмов обладают высокой степенью физической гомологии, а расположение генов на их генетических картах совпадает в 85 % случаев.
Различные гибриды Е. со11-Е. 1урИтипит содержат разные комбинации генов родительских организмов. Поэтому их фенотипы различаются. Такие гибриды представляют собой удобный объект для генетических исследований. Например, фаг Л не развивается в клетках Х гурЫтипига, но инфицирует ряд гибридов, которые унаследовали от клеток Е. со11 гены 1отВ и гер, обеспечивающие его адсорбцию и репликацию.
![](https://s.studizba.com/z.php?f=/templates/si/i/noavatar.png&w=100&h=100&t=1"){kind=avatar}
