Рыбчин - Основы генетической инженерии - 2002 (947310), страница 87
Текст из файла (страница 87)
обзор реп, Ротесгх, 1990). Интересны и перспективны работы по созданию продуцентов белка паутины пауков (С иегеце ег а!., 199б), поскольку прочность на разрыв нитей паутины в расчете на площадь поперечного сечения на порядок превосходит прочность стальных канатов. Человек Медицинские аспекты генетической инженерии затрагивают два круга проблем — диагностику заболеваний и генную терапию. Эти практические разработки "подпитываются" данными, получаемыми в результате реализации фундаментальной международной программы "Геном человека". Вопросы генной терапии были рассмотрены в гл. 13, здесь же коснемся проблем диагностики. Обе проблемы детально освещены в монографии Горбуновой и Баранова (1997).
Существует два вида традиционных реагентов, используемых в диагностике: субстраты для специфических ферментов и антитела для выявления специфических белков. Генная инже- Глава 15. Молекулярная биотехнология 455 нерия ввела в практику еше один реагент — нуклеиновые кислоты — зонды для выявления специфических нуклеотидных последовательностей методом гибридизации. Использование метода полимеразной цепной реакции (см. приложение) для мультипликации тестируемой ДНК обеспечивает высокую чувствительность этих зондов. Они применяются, во-первых, в клинической микробиологии для определения патогенных микроорганизмов — бактерий„вирусов и простейших. Метод гибридизации супшственно ускоряет проведение анализов, но для этого необходимо иметь набор зондов, специфических для разных видов микроорганизмов.
С его помощью можно выявлять микроорганизмы гн зли, в тканях. Нелостатком метода является тот факт, что он не определяет жизнеспособность объектов. Другое применение зондов — диагностика наследственных заболеваний путем нахождения специфических изменений в генах или выявления полиморфизма длин рестрикционных фрагментов (ПДРгР) в заданных генных локусах (см. гл. 9).
Диагностика ниследственных заболеваний. Выше отмечалось, что известно около 5000 наследственных заболеваний. Необходимость их пре- и постнатальной диагностики возникает в разных случаях, например, когда оба родителя являются гетерозиготными носителями мутантного гена и есть вероятность, что ребенок унаследует оба рецессивных аллеля. Кроме упомянутых выше традиционных реагентов возможность пре- и постнатальной диагностики зависит от наличия маркеров для патологических генов. Здесь можно выделить три основных подхода.
Они применяются в зависимости от того, известен или нет ген, дефект в котором вызвал заболевание, известна ли природа мутации, имеется ли к гену зонд и т. п. 1. В гене есть точечная мутация; имеются зонды к нормальному и мутантному участкам гена, Гибридизационные зонды способны выявлять различия в тестируемых последовательностях, составляюгцих даже один нуклеотид.
Это было продемонстрировано на примере 19-членных олигонукдеотидов, комплементарных к одному и тому же участку нормального и мутантного генов Д-глобина (Соппег ег а(., 1983). С их 456 Часть П1. Экспрессия чужеродных генов помощью оказалось возможным различать гомозиготные и гетерозиготные особи. Подобные зонды существуют д.|я фенилкетонурии, дефицита ц,-антитрипсина и ряда других заболеваний. Два других подхода связаны с использованием маркеров„ определяемых по ПДРФ.
Они есть у каждого индивидуума, здорового и больного. Если генетическое заболевание передается потомкам вместе с определенным вариантом ПДРФ, то, значит, мутантный ген сцеплен с ним. Этот вывод позволяет делать соответствующие заключения по итогам пре- и поспгатальной диагностики. 2. В гене или рядом с ним мутация удалила существующий или ввела новый сайт рестрикции; имеется зонд к гену. Этот подход иллюстрируетрис. 9.!1. Первый случай ПДРФ в геноме человека был выявлен при анализе мутантного гена р-глобина, который в гомоаллельном состоя- Рис !5.2.
Определение пола плода человека (а) и крупного рогатого скота (б) методом ПДРФ фрагментов генов АХ и Яру Дорожки 1 и 4 — исходные фрагменты; 2 н 3 — ЛаеП1-рестрнкты; 5 н б — Рег(-рестриктьс слева указаны реперные точки в п.н. Погювая принадлежность фрагментов указана наверху 103 1 2 3 4 5 б в Глава ! 5. Молекулярная биотехнология 457 нии приводит к серповидно-клеточной анемии.
В негритянской популяции США эта мутация оказалась сцепленной с другой мутацией, локализованной вне гена и удаляюшей сайт для рестриктазы Нрп1 (Кап, Г)оху, 1978). Нормальный ген обнаруживался в рестрикте длиной 7,6 т.п.н., а мутантный — 13,0 т.п.н. Этот же подход используется для определения пола на ранних этапах развития плода, что необходимо в случае возможного риска заболевания, сцепленного с полом. У человека на половых хромосомах выявлены высокогомологичные, но не идентичные гены УГХ и гГК С помощью специальных праймеров методом ПЦР были амплифицированы участки этих генов размером 445 (ХГЛ) и 447 (УГУ) п.н. Первый фрагмент имеет 1 НаеШ-сайт, а второй — 2, так что Х и У хромосомы можно различать по рестриктам длиной 400+45 и 317+84+46 п.н., соответственно (Аваев, Мечтало, 1990). Плод мужского пола характеризуется четырьмя рестриктами„а женского — только двумя (рис.
15.2,а). Аналогичные пары генов имеются у всех плацентных млекопитающих, и с помощью тех же праймеров можно амплифицировать схолные участки генов. Для некоторых видов полученные фрагменты ДНК также можно различать по ПДРФ. Например, у крупного рогатого скота фрагмент из У хромосомы расщепляется рестриктазой Гяг( на даа (344+103 п.н.), а фрагмент длиной 445 п.н.
из Х хромосомы остается неизменным (рис. 15.2,6). 3. Ген неизвестен, неизвестны также и первичи ы е б и о х и м и ч е с к и е д е ф е к т ы . Подход впервые был использован для поиска гена, ответственного за хорев Гентинггона (ОвзеПа е1 а1., 1983). Он характеризует так называемую "обратную генетику*', когла от признака, минуя мРНК и белок, выходят непосредственно на ген. Наиболее трудоемким этапом этого подхода является поиск среди минисателлитных зондов (см. гл. 9) такого, который сцеплен с маркером данного заболевания. Для этого анализируют образцы ДНК, взятые у членов многих охарактеризованных информативных семей. В случае успеха отобранный ПДРФ-маркер применяют для картирования гена„который затем клонируют и анализируют. ПДРФ-маркеры 458 Часть П1.
Экенреееня чрнееродньа генов Π— — — — е — °вЂ” ( о .-. --а — ° — ° -в— "7 1 ', и и Х в1 азиз в4 Г 5! 0 — — е — в — °вЂ” е; 4- а — — — ге — ° — ° — ° — ° Т ц .— -в-- °вЂ” в1 0-. — -. а- -+--в-- Р—. -+ — +— вз О -- — —.в — е — ° — °вЂ” 0 — — -+ ° —— е .- — ° --+ — + — ь Рис. 15ль Диагностика наследственного заболевания, вызванного рецессивной мутантной аллелыо гг' неизвестного гена е(: а — строение аллельных рестриктов в ДНК родителей и возможные варианты рестриктов их ребенка; б — - картина блотинга по Саузерну тех же рестриктов.
Жирная точка — повтор; н — число повторов, я — возможные варианты генотипов выявлены и используются для диагностики более ста наследственных заболеваний, включая муковисцитоз, мышечную дистрофию Дюшенна, болезнь Альцгеймера и др. В качестве примера рассмотрим случай, когда клинические проявления некоторой наследственной болезни удалось связать с полиморфным маркером, обусловленным повторами (рис. 15.3,а). Супруги здоровы, но у их родственников болезнь наблюдалась, поэтому они обеспокоены судьбой своего будущего ребенка. Анализ образцов ДНК, взятых у членов их се- Глава 15.
Л1ояенулярная биотехнология 459 мей, позволил установить точную длину ресгрикта, сцепленного с рецессивной мутантной аллелью г( в каждой семье (в нашем примере — 4 и 5 повторов). Оба супруга оказались гетерозиготами по признаку носительства этой аллели. Варианты ПДРФ для их ребенка представлены на рис 15.3„б.
Рекомендация к прерыванию беременности будет дана в случае варианта 84. Если супруги являются родственниками, то с большой вероятностью их аллели Н будут одинаковыми. Следует принимать во внимание вероятностный характер выводов, присущих рассматриваемому подходу. Несмотря на сцепленность ПДРФ-маркера с мутантной аллелью не исключена рекомбинация между гомологичными хромосомами в анализируемой области, что может привести к ошибке в диагнозе. Геномиия дактилоскопия. Гибридизационные зонды к минисателлитам стали эффективным средством в так называемой геномной дактилоскопии, т.е.
метода выявления индивидуальных различий и особенностей у людей на уровне структуры ДНК (1е1Тгеуз ег а!., 1985). Метод основан на явлении ПДРФ. Как уже отмечалось, минисателлиты в определенных локусах у разных не родственных особей отличаются по длине (числу тандемных повторов), что может быть выявлено с помощью блотинга по Саузерну, в котором зондами служат клонированные участки минисателлитов. Один зонд позволяет наблюдать одновременно за наследованием нескольких десятков минисателлитов, расположенных в разных локусах, но относящихся к одному семейству.
В среднем разрешению и учету поддаются приблизительно 20 фрагментов размером более 3 т.п.н. Поскольку каждый из локусов полиморфен (как правило, более шести вариантов), а локусы независимы друг от друга, то образующийся набор полос специфичен для каждого индивидуума (вероятность совпадения картин у двух не родственных лиц равна приблизительно! О-н) и является его генным '*отпечатком пальцев". При использовании двух разных зондов названная вероятность совпадения ничтожно мала.
![](https://s.studizba.com/z.php?f=/templates/si/i/noavatar.png&w=100&h=100&t=1"){kind=avatar}
