Рыбчин - Основы генетической инженерии - 2002 (947310), страница 89
Текст из файла (страница 89)
Бумага служит своеобразным капиллярным насосом, способствуя вымыванию фрагментов ДНК током буфера из геля и переносу их на мембрану. Далее ДНК денатурируют щелочью, а мембрану выдерживают при 80 'С или облучают УгР-светом, что позволяет фиксировать ДНК на мембране. Затем мембрану помещают в раствор с меченым зондом, в котором и происходит гибридизация. После отмывки несвязавшейся ралноактивпостн результат выявляют с помощью радиоавтографии.
Стандартные условия блотинга по Саузерну не применимы к РНК„так как она не связывается с обычными нитроцеллюлозными и нейлоновыми мембранами. Для иммобилизации РНК вначале был предложен специальный вид бумаги с диазобензилоксиметилом (!ЗМВ-целлюлоза), а затем были найдены условия лля нековалентного связывания РНК с нитроцеллюлозой (предварительная денатурация РНК диметилсульфоксидом, формальдегидом и др.) и разработаны лля этого подхолящие нейлоновые фильтры. По аналогии с блотингом по Саузерну (зоц!!тегп — южный) этот вид блотинга был назван нозерн (побтегп — северный).
В продолжение этой аналогии метод переноса белков из полиакриламидного геля на нитроцезщюлозные или нейлоновые мембраны (Вигпеие, !98 !) был назван вестерн (тнеагег1т — восточный). Г:. ' ... л — — - — Стекло — — — — Фильтронтльнае бтмма — Ватман — .....: †.. - .-- — к!набрана Гель 1 — ватман -1-- Буфер Рис. П.!. Схема блотшва по Саузерну Приюженве 467 Отметим, что в описанных видах блотинга для организации потока ДНК, РНК и белков через гель к мембране вместо капиллярных сил используют также злектрофорез и вакуум.
Полимеразная цепная реакция Полимеразная цепная реакция (ПЦР) позволяет за небольшое время увеличить количество специфической последовательности ДНК в миллионы раз (Мийз, Га1оога, 1987). Для ее осуществления необходимо иметь два праймера, фланкирующих эту последовательность и ориентированных в направлении 5" — >3 ' в ее сторону. Таким образом, праймеры гибридизуются с противоположными нитями ДНК, и при добавлении ДНК-полимеразы синтез ДНК идет на обеих нитях между праймерами. Эффект умножения специфической последовательности ДНК достигается путем многократного повторения трех последовательных реакций: денатурации, ренатурации (связывание праймеров) и синтеза ДНК.
Смена типа реакции задается изменением температуры реакционной смеси:95 (0,5 мин) — 55 (1,5 мин)— 70 С (1 мин). Указанные температуры являются средними. Их конкретные величины определяются строением праймеров и свойствами используемой ДНК-полимеразы. В первом цикле после денатурации ДНК (95 "С) и связывания с ней праймеров (55 'С) ДНК-полимераза образует двунитевые структуры, в которых родительские нити ДНК соединены с вновь синтезированными комплементарными нитями различной длины, но с фиксированным 5'-концом (рис. П.2). Уже во втором цикле образуются обе нити специфической последовательности, имеющие заданные размеры. В третьем цикле эти нити дают, наконец, начало двунитевым детерминированным по размеру фрагментам ДНК.
В каждом последующем цикле их число удваивается, достигая теоретически к 22-му, а на практике к 30-му циклу более миллиона копий. Исходные молекулы ДНК и структуры, образовавшиеся в первом цикле, присутствуют в реакционной смеси к концу ПЦР в ничтожных количествах. 46й Приложение ие ян» двк 5' — ---. -- — — — - — — — —. -- — — 3' з--. р денетуреяня (рз С) и еимывенне в)ийиерзв тзУ") Рис. П.2.
Начальные циклы полимеразной цепной реакции. Тонкислинии — вновь синтезировашеая ДНК; жирная черта — праймср. В первом пнкче показаны послсдовательпыс реакции; во втором и третьем циклах нс показана судьба исходной ДНК. Г!срвый дуплекс мультиплицированной ДНК цоявлястся в третьем цикле Синтез дик (70 с) 5' з' денвтурвиия и евяззыение ирезмеров т з' Стандартная ПЦР осушествляется автомати )вски в термоциклере в одной пробирке, содержашей около ) мкгДНК, 20 пикомолей каждого праймера, по 50 мкмолей каждого дезоксипуклеозидтрифосфата н две единицы термостабильной ТаС) ДНК-полимеразы.
Ее преимушеством является термостабильность, недостаз— ком — отсутствие 3 '-+5 ' зкзонуклеазцой активности, что приводит к появлению ошибок в синтезированной ДНК (см. гл. 6)около 0,25% в конечном продукте. Конечно, зта величина не препятствует использованию таких ДНК в качестве гибридизационных зондов. Однако при установлении структуры индивидуальной ДНК следует просек- з 5' о двк 5' з урн и евззывии» ирймерав 5' з 5' ~ с днк 5' 3 йцииз з' 5' з у з 5' з' венировать независимо выделенные клоны, надежнее всего -- взятые из отдельных реакционных пробирок.
Кроме того, енот ферме)п имеет тенденцию добавлять к 3'-копнам дуплек- Лр!!ложен!!е 469 сов дополнительные алениловые останки, гюэ!ому концы у дуплексов неровные. 9!о вызывает необхо!!г!ь!Ос!ь выравнивать концы перед клонированием мультиплицированного фрагыен.н!. О!метим, наконец, что последовательности ДНК длиной более 3 т.нл!. умножаются этой полимеразой неэффективно.
Указанные недостатки отсутствуя>т у ДНК-полимераз Ргоо1т3рг!и!ег™ и АО5ОоЯ™ предлагаемь!х фирмои «Нуба1!1» С их помошью меж~о си!пези1!слать с повышенной точ!юсть!о фрагменты размером до 15 — 20 т.п.н. Облас!ь применения ПЦР велика и постоянно расширяется: диагностика генетических заболеваний, обнаружение генетического материала патогенных микроорганизмов в клинических образцах, синтез гибридизапио!шых зондов, создание библиотек кДНК из малых количеств мРНК, мультипликация ДНК для целей секвенирования, направленный мутагенез и др.
("Оепецс епяепееппя !г1!1! РСК**, 1998). Успех конкретной ППР сугцественно зависит от правильного выбора праймеров. Чтобы минимизировать возможность неправильного спаривания, праймер должен соответствовать некоторым требованиям. Его длина должна быть 17 — 30 нуклеотидов при содержании ОС-пар около 50%. Чем ниже содержание СС-пар в праймере, тем длиннее он должен быль.
Следует избегать появления вторичных структур в праймере и более трех — четырех одинаковых нуклеотидов подряд. Используемые в одной реакции праймеры не должны иметь комплементарных участков. С помощью праймеров мультиплицируемую ДНК можно ограничивать с обоих концов последовательностями по выбору экспериментатора. С этой целью дополнительная последовательность нуклеотидов синтезируется на 5'-конце праймеров. В первом цикле праймеры связываются с ДНК только своей 3'- частью, но уже в последуюших циклах дополнительная последовательность включается в мультиплицируемую ДНК и праймеры гибридизуются с ней по всей длине.
Так обычно снабжают синтезированный дуплекс сайтами рестрикции, обеспечивая с их помошью возможность его клонирования. 470 Прияожелле Компьнперные методы Компьютерные программы, используемые в генетической инженерии, предназначены для накопления и хранения первичных данных о структуре нуклеиновых кислот и белков, для анализа структурных и биологических свойств их последовательностей, а также для планирования сгратегии синтеза олигонуклеотидов (генов) и белков (" Компьютерный анализ генетических текстов", 1990). Традиционные программы„предназначенные для работы на персонапьных компьютерах, собраны в пакеты. Из них можно упомянуть РССЕ)чЕ, распространенный в российских лабораториях.
По данным сиквенса одной нити программы "строят" комплементарную нить, подсчитывают состав оснований, выделяют области, богатые ОС- или АТ-парами, представляют частоты встречаемости различных динуклеотидов, дают информацию о локализации специфических сайгон и т. д. Р!рограммы отыскиваюг прямые и инвертированные повторы в ДН К„причем можно задать степень негомслогичности и длину "сгебгш** шпильки. Нетривиальные повторы могут служить регуляторными сайтами, образуя совместно с ре~уляторными белками и вспомогательными факторами характерные структуры в самой ДНК или в РНК-транскрипте.
Анализ на наличие и локализацщо сайтов рестрикции, информация о числе и размере рестриктов, образуемых действием одной несколькими рестриктазами, позволяют планировать эксперименты по клонированию определенных участков гепомной ДН К. При этом программы учитываю~ форму ДНК (линейная или кольцевая). С внедрением сети 1п1егпе1 стало возможным проводить сложные анализы с использованием мощных международных вычислительных центров и банков данных.
Анализ плруктуры генома. К настоящему времени известны полные нуклеотидные последовательности многих сотен плазмидных и вирусных ДНК, а также ряда клеточных гецомов (см. гл. 9). Отметим прежде всего, что само установление первичной последовательности ДНК невозможно без использования компьютерных методов. В случае секвенирования методом зйог-р~п в компьютере накапливаются данные по секвенированию отдельных участков генома, и при появлении перекрывающихся последова- Лриложемие 471 тсльностсй они группируются в контиги.
Далее контиги наращиваются по длине и постепешю обьединяются (б1адеп, ! 986). Компьютерные программгя ведут этот процесс с учетом данных по секвенированию обеих нитей, выявляют расхождения в данных и выводят рекомендации гю стратегии и тактике ссквенирования. В автоматических секвенаторах детектор сканирует авгоралиограммы и вводит данные прямо в компьютер. Программы по секвенированию геномов высших зукариот поставили перед компьютерными инженерами и программистами серьезные проблемы. Только хранение последовательносги в 1 млн.п.н. требует приблизительно одного мегабайта компьютерной памяти.
Таким образом, данные по человеческому геному займут три гигабайта памяти, и это не считая объема, необходимого для аннотаций и обслуживания этой информации. Развиваются программы для распознавания зкспрессирующихся генов и идентификации однонуклеотидного полиморфизма как меры вариации человеческого генома. Анализ найденных последовательностей нуклеотидов начинают с установления открытых рамок считывания (ОКЕ), которые могуг соответствовать определенным генам. Для этого специальные программы переводят нуклеотидную последовательность в аминокислотную по всем трем рамкам считывания каждой из нитей ДНК.
![](https://s.studizba.com/z.php?f=/templates/si/i/noavatar.png&w=100&h=100&t=1"){kind=avatar}
