Рыбчин - Основы генетической инженерии - 2002 (947310), страница 86
Текст из файла (страница 86)
Микроорганизмы Описание штаммов микроорганизмов, несущих рекДНК и синтезируюгдих различные препараты полипептидной природы, содержится во многих главах книги. Генная инженерия сделала также возможным вмешательство в метаболические пути микроорганизмов с тем, чтобы заставить их синтезировать низкомолекулярные вещества промышленного назначения. В этом перечне значатся краситель индиго (Мцп)осх ег а!., 1993), пигмент меланин (Рейа-Сорра ег а1., !990), витамин С (1луагцв е1 а)., 1990), новые антибиотики (см. обзор Норогоос1, !993). Сконструирова- Глава 15 Молекулярная биотехнология 449 ны штаммы Х сегелк1ае, существенно сокращающие сроки созревания пива (Яш1зйо ег а(., 1990) и обладающие лучшими пекарскими свойствами (Кояегз ег а1., 1990).
Велугся работы по созданию генно-инженерных штаммов почвенных бактерий, в частности, азотфиксирующих ризобий, с повышенной конкурентоспособностью и симбиотической эффективностькх Уже осуществлен выпуск в среду многих таких штаммов. Растения В сельском хозяйстве за последние десятилетия селекционные методы позволили получить культуры с повышенной урожайностью и устойчивостью к вредителям, с улучшенными питательными качествами.
Селекция сохранит свое значение и в будущем, но все более существенную роль будет играть сочетание методов генетической' и клеточной инженерии, что позволит значительно ускорить прогресс в создании модифицированных или новых видов полезных сельскохозяйственных растений. Как уже упоминалось, растения, выращенные из изолированных клеток, часто отличаются по генотипу от растений, из которых эти клетки были взяты, что облегчает поиск линий с улучшенными агрономическими свойствами. Причем в отдельных случаях отбор можно вести на уровне клеток, не ожидая регенерации из них целых растений. Успехи генной инженерии растений в прикладных аспектах развиваются по нарастающей.
На первом этапе были получены трансгенные растения с полезными моногенными (устойчивость к гербицидам или вирусам) и даже мультигенными признаками. Следующим этапом было создание растений с улучшенными вкусовыми и питательными характеристиками и улучшенными товарными свойствами. На очереди использование растений в качестве фабрик для синтеза фармацевтических и химических пролуктов.
Насекомые, грибы, сорняки и вирусы — природные враги культурных растений. Для борьбы с ними традиционно используют химические методы, которые, как правило, неселективпы, 450 Часть П!. Экелреегия чужеродных генов дорогостояши и экологически небезопасны. Генетическая инженерия предложила альтернативные методы. От насекомых особенно страдают картофель, кукуруза и хлопчатник. Большим успехом бьшо введение в практику природных инсектицидов — токсинов белковой природы, вырабатываемых бактериями Вас!Пих гйиплрелхи. Они лают до 90 % биопестицидов, используемых в настоящее время.
В каждой клетке накапливается свыше миллиона молекул токсина, поэтому они образуют кристаллы. Гены токсинов сеу локализуются на плазмилах. Разные штаммы синтезируют токсины разной специс1~ичности, безвредные для позвоночных и полезных насекомых. Наиболее широко они используются против гусениц чешуекрылых насекомых путем распыления препарата на полях. Конечно, его действие непродолжительно, поскольку он смывается с растений. Введение гена токсина в трасгенные помидоры, табак и хлопок позволило получить устойчивые к насекомым растения, которые хорошо зарекомендовали себя в полевых испытаниях. Кроме использования растителыюй экспрессионной кассеты, для этого пришлось провести "эукариотизацик1" гена, т. е.
заменить в нем неоптимальные для растений колоны на оптимальные, модифицировать некоторые последовательности, дестабилизирующие мРНК и т. д. (Сагохх) е! а)., 1992). Разрабатываются способы борьбы с патоге ни ы ми гриб а м и . Успешным оказался опыт по защите трансгенных помидоров и рапса от Ипсосгол)а во(ал! с помощью хитиназы бобов, ген которой был введен в растения (Вгояйе ег а(., 1991). Сорняки губят до 70% урожая, конкурируя за влагу, свет и питательные вещества.
Используемые для борьбы с ними гербипиды блокируют реакции, присущие большинству растений, поскольку сорняки представлены многими видами. В какой-то степени страдают от них и сами вырашиваемые культуры. Чтобы сделать их устойчивыми к ! ерби цидам, испогзьзуют два подхода: их молекулу-мишень делают нечувствительной для гербицида (например, путем ес перепроизводства), либо в растение вволят ген, продукт которого разрушает или модифицирует гербицид. Глава 15. Молекулярная бион>ехнологоя 451 Примером первого подхода является создание петунии, устойчивой к глифосату (ЯЬаЬ е1 а1., 1986).
Этот гербицид ингибирует 5-енол-пирувилшикимат-З-фосфатсинтазу, ключевой фермент синтеза ароматических аминокислот в растениях и бактериях. На клеточном уровне была отобрана линия, устойчивая к глифосату благодаря мультипликации синтазного гена. Этот ген под контролем промотора каулимовируса был введен в растение. В трансгенных петуниях мультиплицированный ген экспрессировался в хлоропластах, существенно повышая устойчивость растений к глифосату.
Эффективность второго подхода была продемонстрирована на примере создания культур, устойчивых к фосфинотрицину. Этот гербицид необратимо ингибирует глутаминсинтетазу у растений и бактерий. Стрептомицеты Юггергол>усек )>у8гохсор>сох способны инактивировать фосфинотрицин путем его ацетилирования. Их ген 6аг, кс>дируюший ацетилазу, с помощью агро- бактерий был введен в картофель, табак и помидоры. Полученные трансгенные растения успешно прошли полевые испытания на устойчивость к фосфинозрицину (Е)е атее( ег а(., 1989). Разрабатываются разные подходы для создания растений, устойчивых к вирусам (Р1!сЬеп, ВеасЬу, 1993), но наиболее универсальным методом остается получение трансгенных растений, содержащих ген оболочечного вирусного белка. В таких растениях развитие родственных вирусов существенно замедляется, гго впервые было показано для табака и томатов, подверженных инфекции вирусом табачной мозаики (Ро>не! 1-АЬе! ег а!., 1986).
Антисмысловые РНК были использованы для увеличения сроков хранения помидоров путем подавления синтезаполигалактуроназы (ЯйееЬу ег а1., !988) и фитогормона этилена (Ое!!ег ег а1., 1991), вовлеченных в процесс их созревания и размягчения. Интересные опыты ведутся по изменению пищевой ценности растений в тех случаях, когда известны генетика и биохимия того или иного процесса. Например, вмешательством в генотип удается менять качество крахмала, изменяя относительное содержание двух его главных компонентов — амилозы (линейный полимер) и амилопектина (ветвистый полимер). 452 Часть Ш.
Экснреесая чужеродных еенае Можно модифицировать спектр синтезируемых растением жирных кислот, направляя их использование для пищевых или промышленных целей. Выращивание растений не требует специального оборудования и дорогих химпрепаратов, поэтому растительные продукты относительно дешевы. По этой причине ведутся работы по использованию трансгеш|ых растений в качестве "фабрик" для производства специализированных веществ, например, животных белков медицинского назначения ~интерферан, знкефалины, сывороточный альбумин, иммуноглобулины и т. п.).
Трансгенные растения уже вылили из лаборатории. В )994 году впервые на рынке появились томаты, которые остаются твердыми многие недели после их сбора. Прошли полевые испытания устойчивые к гербицидам табак, хлопок, картофель, помидоры„кукуруза, свекла, раис„салат-латук и др. Главный вопрос, который при этом ставился — впишутся ли опи в экосистему'? Ьудут ли они вытеснять другие виды или будут сами вытеснены? Это не только вопрос их устойчивости, но также их влияния на окружение. Например, раис с геном хитиназы устойчив к грибным патогенам, но не будет ли хитиназа токсичной для пчел? В этом случае было показано, что нет, а многие другие вопросы остаются пока без ответа. К примеру, не перенесется ли ген устойчивости от полезного растения к какому-нибудь сорняку или паразиту, скажем„через пыльцу, вирус или микроб? Животные Наиболее полезным в практическом плане применением генной инженерии животных явилось создание линий трансгенных мышей, моделирующих наследственные заболевания человека— атеросклероз, болезнь Альцгеймера, саркому Капоши, мышечную дистрофию и лр.
Эти животные были использованы для разработки и испытания средств борьбы с такими заболеваниями. Интересен метод использования трансгснных мышей для тестирования гя иуо мутагенности разных химических соединений (КоЫег его?., 1990). Тестерный ген lас7 бьш введен в мышь с Глава ! 5. Иолеяулярноя биоглехаология 453 помощью 7. вектора. После действия мутагена из разных тканей мыши выделяли геномную ДНК, а из нее методом упаковки в фаговую головку рл иво "спасали" векторную ДНК. Рассев фагов на амазон клеток Е сой (осе. с использованием среды Хйа! позволял по отношению числа бесцветных негативных колоний к голубым (см. гл. 7) определять частоту мутаций.
Попытки вмешательства в геном сельскохозяйственных животных и птиц имели пока ограниченный успех. Можно упомянуть только о создании трансгенных цыплят, устойчивых к вирусу лейкоза птиц (Яа1гег, Сп!!еп, 1988). В их геном был введен экспрессирующийся ген оболочечного гликопротеина этого вируса. Многочисленные попытки введения в ДНК домашних животных генов гормона роста разного происхождения не привели к заметному зкономическому эффекту.
Например, у транс- генных свиней наблюдалось значительное увеличение дневного привеса и уменьшение жирности мяса„причем зти характеристики сохранялись в ряду поколений. Но, с другой стороны, многие животные страдали от различных заболеваний и обладали пониженной фертильностью. Вывод из результатов этих экспериментов очевиден: необходимо поставить экспрессию вводимых генов под приемлемый для поставленной цели контроль. Это, конечно, потребует проведения фундаментальных исследований молекулярной физиологии каждого вида животных. Активно разрабатывается идея создания ферм домашних трансгенных животных, в молоке которых содержатся белковые препараты медицинского назначения. Молочные железы являются идеальным '"ферментером" для производства таких препаратов, поскольку: 1) продукт модифицирован должным образом; 2) находится вне клеток в жидкой фазе в достаточно высокой концентрации; 3) стерилен.
Конечно, вводимый ген лолжен быть подчинен тканеспецифическому промотору. Так, с помощью гена а,-антитрипсина ААТ, поставленного под контроль промотара гена р-лактоглобулина, были получены транс- генные овцы, в молоке которых содержится до 35 г/л этого белка (Фп8й! е! а(., 1991). а,-антитрипсин является ингибитором 454 Часть 111. Экет1реееив чужеродвых генов протеазы эластазы. Лица„у которых отсутствует этот белок, предрасположены к заболеванию эмфиземой легких и циррозом печени в детском возрасте, так как у нпх постепенно распадается соединительная ткань.
Его внутривенное введение служит для больных лекарственным средством. Аналогичным образом были получены козы„продуцирующие активатор тканевого плазминогена человека 1РА (Ебег1 е1 а1., 1991). Проведены также эксперименты по получению гормонов, факторов роста и коагуляции, антитромбогенных факторов, моноклональных антител, антигенов лля вакцинации и диагностики, разных ферментов и т. п.
Получение трансгенных промысловых рыб ведется в трех направлениях: увеличения скорости их развития и прибавки веса путем введения в них генов гормонов роста, повышения их хололостойкости с помощью введенного гена АРР„кодирующего белок-антифриз, и придания устойчивости к вирусным заболеваниям с помощью противовирусных антисмысловых РНК (см.
![](https://s.studizba.com/z.php?f=/templates/si/i/noavatar.png&w=100&h=100&t=1"){kind=avatar}
