Рыбчин - Основы генетической инженерии - 2002 (947310), страница 88
Текст из файла (страница 88)
Поэтому геномная дактилоскопия стала широко применяться в области криминалистики и судебно-медицинской экспертизы. 460 Часть Ш. Экегигеееил чужеппдньгт геипе Гипервариабельные участки, содержащие множественные повторы, имеются и в митохондриальной ДНК. Анализ амплифицированных участков этой ДНК позволил иденптфицировать останки Николая П и его семьи 1О111 ег а!., 1994). Любопытно, что оказалось возможным использовать ДНК фага М13 в качестве универсального зонда для геномной дактилоскопии различных живых существ.
Это вызвано наличием в фаговом гене 7Ндвух С)С-богатых повторов. С помошью клонированного фрагмента этого гена, содержащего один из повторов, выявлено универсальное семейство гипервариабельных последовательностей, встречающееся у организмов различной таксономической принадлежности, от прокариот и низших эукариот до высших растений и животных, включая человека (Джинчарадзе и др., 1987; Уаззап ег а)., 1987). Это открывает новые возможности для генотипирования организмов, маркирования индивидуальных хромосом и генов, изучения генетической структуры популяций, энолюционных исследований, паспортизации пород, сортов и штаммов микроорганизмов и т.
и. ДНК как медияггнекий продукт. Успехи в изучении генома человека и появление возможности использования генов в лечебных целях привели к созданию многих биотехнологических фирм, специализирующихся в обслуживании генной терапии. Одни занимаются идентификацией генов, другие разрабатывают методы переноса и экспрессии генов в клетках пациента, третьи готовят антисмыслоные РНК как средство подавления нежелательной экспрессии генов и т.д. Эксперты предсказывали проведение первых коммерческих операций по генной терапии к концу этого века. Но пока ни один продукт для генной терапии не коммерциализирован, хотя сделаны сотни клинических экспериментов.
В большинстве из них получены обналежинаюшие результаты, но эффективность и безопасность продемонстрирована далеко не всегда. Остаются и этические проблемы. Сказанное можно отнести и к ДНК-вакцинам (см. с. 448). Другие проблемы Ряд проблем, в решении которых большие надежды возлагаются на генетическую инженерию, носит комплексный характер. Глава 15. Молекулярная биотехнология 461 К ним относится проблема повышения плодородия почв. Использование для этих целей удобрений, главным образом азотистых, не дает желаемого эффекта по двум причинам. Вопервых, химическии синтез азотистых удобрений идет с помощью энергоемкого и дорогостоящего процесса.
Во-вторых, для создания в почве нужной концентрации удобрений их вносят в избытке и они в значительном количестве вымываются, что приводит к загрязнению водоемов и к экологическим сдвигам в окружакидей среде. В связи с этим генетической инженерии предстоит разработать способы использования биологической системы фиксации азота для обеспечения солями аммония сельскохозяйственных культур. Возможны несколько вариантов решения этой задачи: применение свободно живущих бактерий, фиксирующих азОт, или изолирОваннОй модифицирОваннОй нитрогеназы (фермент, ведущий биологическую азотфиксацию) в промьплленном производстве аммиака; повышение эффективности природных азотфиксируюших бактерий-симбионтов и разработка новых симбиотических ассоциаций; введение генов азотфиксации (иК-генов) в культурные растения и др.
Конечно, предварительно нужно провести работу по вьиспе1~ию механизмов симбиотических взаимоотношении, разработке способов защиты нитрогеназы от действия кислорода, по расшифровке систем регуляции нитрогеназы и т. и. В решении таких фундаментальных проблем тоже ожидается помощь от генетической инженерии. Коьп1лексный характер носит и проблема использования промышленных, сельскохозяйственных и бытовых отходов, накапливающихся в огромных количествах в развитых странах. И здесь биотехнология с помощью специально сконструированных микроорганизмов обеспечит превращение части :пих отходов в продукты, которые сейчас получают из нефти. :)то один из путей, предлагаемых генетической инженериеи лля решения проблемы, возникающей в связи с исчерпанием ь мире невозобновляемых источников энергии.
Параллельно при этом будет решаться задача по охране окружающей среды. Уже в настоящее время для получения микробного кормового 462 Часть 1П. Экелреееан нужеродньп генов белка используют п-ялкапы, содержащиеся в побочных продуктах очистки нефти; ме~ан, выделяющийся из нефтяных месторождений; метанол, получаемый из этого метана, и т, д.
В том же плане широкий резонанс вьювал бразильский эксперимент по производству этанола из сахарного тростника и маниоки и использованию полученного спирта в качестве топлива для автомобилей. На основании результатов данного опыта в некогорых странах приступили к разработке методов превращения в жидкое или газообразное топливо промышленных отходов. В целом можно подчеркнуть, что генетическая инженерия способна оказать серьезное влияние на многие отрасли народного хозяйства. Биологизация производства — это завтрашний день технологии, и решающее значение здесь будет принадлежать генетической инженерии. ВОПРОСЫ ДЛЯ ПОВТОРЕНИЯ И ОБСУЖДЕНИЯ 15.! .
Прелложите план экспсримента по объелиненюо в одном полицептиде двух Функциональных доменов разных белков. 15.2. Как можно изменять специфичность действия токсинов? 15.3. Опишите подходы к созданию генно-инженерных вакцинных препаратов. Каковы преимущества ДНК-вакцин? ! 5.4. В каких прикладных аспектах развивается молекулярная биотехнология микроорганизмов? 15.5. Охарактеризуйте преимущества и недостатки химических и генно-инженерных методов защиты культурных растений. 15.6. Какие практические задачи можно решать, используя трапсгенных животных и рыб? !5.7. В каких случаях используют метод "обратной генетики" цри диагностике наследственных заболеваний? 15.8.
Как определяют пол плода на ранних этапах его развития? 15.9. На чем основана геномная дактилоскопия? Может ли она служить генным паспортом человека? 15.10. Обсудите возможности генетической инженерии в ре1вении экологических проблем. Гель-злектрофорез Молекулы ДН К отрицателыго заряжены, поэтому в электрическом поле они движутся от отрицательного полюса к положительному„сворачиваясь в глобулы.
В свободном растворе электрофоретическая подвижность глобул не зависит от их молекулярного веса. Однако в толевой среде, состоящей из пор, молекулы ДН К разного размера тратят разное время на преодоление пор, так гго скорость их миграции сквозь гель (при напряженности поля, не превышаюгцей 5 В/см) становится обратно пропорциональной логарифму числа нуклеотидных пар в ДНК (Аац, Вогзг, 1972). Скорость движения в геле молекул ДНК определенного размера зависит от их конформации. В стандартных условиях сунерскрученные кольцевые молекулы лвижутся быстрее никированных кольцевых молекул, последние в свою очередь обгоняют линейные фрагменты ДНК.
В редких случаях порядок следования этих форм ДНК обратен. В качестве гельобразующего вещества используют линейный полимер агарозу или полиакриламид. Агарозные гели готовят путем растворения агарозы в подходящем буфере. Полиакриламидцые гели готовят, полимеризуя акриламид (СН,=СН-СО-НН,) в присутствии персульфата аммония, 1х(ХХ'Х'-тетраметилдиамина (ТЕМЕВ„инициатор линейной полимеризации) и Х')ч-метиленбисакриламида (образование межцепочечных сшивок). Смесь заливают между двумя пластинками, где и образуется гель. Процесс разделения фрагментов ДНК в полиакриламидном геле весьма чувствителен: фрагменты длиной до 500 п.н.
разделяются, даже если они отличаются всего на 1 нуклеотид. Чем выше 4б4 Приложение концентрация этих веществ, тем мельче поры геля и тем медленнее движутся сквозь гель молекулы ДНК определешюго размера. Это позволяет, используя гели различной кон1~ецтрации„ разделять молекулы ДНК в широком диапазоне их размеров, вплоть до 50 т.п.н. (табл. П. !). Процесс разделения прекращается, когда размер глобул превышает максимально возможный размер пор. В таких случаях используют электрофорез с пульсирующим электрическим полем или электрофорез с инверсией поля„которые позволяют разделять молекулы ДНК размером до 2000 т.п.н.
Таблица П, ! Зависимость длины разделяемых фрагментов ДНК от концентрации агарозы ичн аяриламидв в геле. В методе гель-электрофореза в пульсирующем поле (рц)зецВе)г! яе! е!ее!гор(тогеа1з, РЕБЕ) используются лва взаимно перпендикулярных электрических поля, включающихся попеременно (ЯсЬгагтх, Сап!от, )984). Молекулы ДНК движутся в таких полях в обоих направлениях, поэтому траектория их движения искривлен~а, что составляет определен п~ые неудобства при анализе данных. Указанный недостаток отсутствует в методе с инверсией электрического поля (беЫ-1птегз(оп Ке! е)ее!гор)зогезж, Е)СЕ). В этом случае направление поля периодически меняется на противоположное, и молекулы ДНК движутся вперед-назад с паузой между лвумя импульсами.
Такои режим помогает преодолевать поры геля даже большим молекулам ДНК, которые при этом лвижутся по прямой линии. Приложение 4б5 Для электрофореза двунитевых молекул ДНК используют обычно 50 мМ трис-боратный буфер (ТВЕ) рН7,5 — 7,8, а разделение однонитевых ДНК ведут в денатурирующих условиях (ХаОН в агарозном геле, мочевина или формамид в полиакриламидном геле). В препараты ДНК добавляют интеркалирующее вещество этилиум бромид, который флюоресцирует под действием УФ-света, позволяя выявлять до 0,05 мкг двунитевых ДНК в одной зоне. Однонитевые ДНК выявляются существенно яуже.
Оценку размеров ДНК в зонах производят, опираясь на данные о размерах рестриктов секвенированных молекул ДНК. Как правило, в качестве реперных фрагментов известной длины используют рестрикты ДНК фага )., для которых предназначают одну из дорожек гелевой пластинки. Они позволяют определять размеры рестриктов изучаемой ДНК. Кроме того, зная концентрацию реперной ДНК, можно по степени интенсивности зон сделать оценку количества ДНК в изучаемых препаратах. Гель-электрофорез используют не только для аналитических, но и для препаративных целей. Отмечено также, что связывание белка с фрагментом ДНК уменьшает его элекгрофоретическую подвижность, позволяя таким образом изучать особенности взаимодействия белок-ДНК. Блатииг нуклеиновых кислот Термин блотинг применяют к процедуре иммобилизации нуклеиновых кислот или белков на твердой подложке, обычно на нейлоновых или нитроцеллюлозных мембранах. Иммобилизованные ДНК и РНК используют в последующих гибридизационных экспериментах с целью детекции специфических послеловательностей.
Техника блотинга различна для разных источников нуклеиновых кислот. Блот по Саузерну (Яовгйегп Ыог) и нозерн блот (по01егп Ыог) используют, соответственно, для извлечения ДНК или РНК из геля. Иммобилизацию ДНК из раствора велут методом дог блота (бог Ыог). Процедура блотинга содержится и в методе гибридизации колоний при скрининге банка генов (см.
гл. 9). 466 Прилолеение Саузерн (8оц!пегп, 1975) предложил оригинальную идею по переносу фрагментов ДНК из агарозного геля на гибридизационную мембрану. Гель помещают на фильтровальную бумагу, находящуюся в контакте с буфером. Мембрану накладывают на гель, а сверху укладывают несколько слоев фильтровальной бумаги, легко абсорбирующей влагу (рис. П.!).
![](https://s.studizba.com/z.php?f=/templates/si/i/noavatar.png&w=100&h=100&t=1"){kind=avatar}
