Рыбчин - Основы генетической инженерии - 2002 (947310), страница 85
Текст из файла (страница 85)
Такая возможность основана, во-первых, на том, что в природе сходные биологические функции у разных организмов обеспечиваются белками, проявляющими самые разнообразные физико-химические и биологические свойства Вовторых, известно„что у многих полифункциональных белков функциональные домены действуют независимо друг от друга, так как они организованы в структурные домены.
Геа А Статеек (д-кати вектора Обмен доменами удобно проводить с помощью метода ПЦР (С!ас1сзоп, %1п(ег, 1989). Для этого синтезируют праймеры, комплементарные к границам переносимого домен-кодирующего „-- — з ~ пцр У' ' — "~ 5' т гавр л а с (+)-аиоао вектора Рис. 15.1. Последовательные этапы замены домен-кодирующего участка гена 8 на участок гена А с помощью метода ПЦР. Волнистые линии а праймерах — последовательности, комплементарные к концам замещаемого домена в гене В; ген в, клонированный в олнонитевом векторе, выделен жирной линией Глава ! 5, Молекулярная оиотеянология 445 участка гена А, причем на их 5'-концах предусматривают последовательности, комплементарные к концам замещаемого домен-кодирующего участка гена В (рис.
! 5.1). Этн последовательности сохраняются в получающемся дуплексе (см. приложение). Ген В клонируют в однонитевом векторе, что позволяет одной из нитей дуплекса связаться с ним и образовать своеобразный шунт замещаемому домен-кодируюшему участку. Нить дуплекса служит праймером для копирования основной части вектора. В результате синтезируется комплементарная нить вектора, которая содержит ген В с замешенным домен-кодирующим участком. Примером успешного обмена функциональными доменами, взятыми у родственных белков, служат эксперименты по получению методом рекомбинации гд и!го и !л у!уо гибридных а-ннтерферонов человека (8геЬЬ1п8, Мау, 1982) и мыши (Хваггйо1Т сг а!., 1987).
Некоторые варианты гибридных белков имели существенно ббльшую противовирусную активность, чем родительские формы. Два различных белка — человеческие у-интерферон и интерлейкин-2, объединенные в один полипептид, проявляли в нем обе активности (8епо ег а!., 1986). Этот результат позволяет ставить вопрос о создании белковых лекарственных препаратов комбинированного действия.
Интересен пример конструирования рестриктазы, специфичной к Х-ДНК (К!ш ег а!., 1997). В этой работе нуклеазный домен рестриктазы ГоН был '*сшит'" с доменом Х-а из Ы-терминальной области человеческой аденозиндеаминазы двунитевой РНК (йАВАИ). В результате была создана конформационно-специфическая эндонуклеаза, расщепляюшая только такие плазмиды с отрицательной суперскрученностью, которые содержат Х-ДНК, например вставку (с!С-дО) г К категории гибридных белков относятся также искусственные рецептор-опосредованные токсины, включая иммунотоксины. Многие бактериальные полипептидные токсины состоят из двух компонентов — активной субъединицы А и субъединицы В, узнающей клеточный рецептор и позволяющей 44Ь Часть 1И. Экспрессия чуекеродньи генов токсину проникнуть в клетку.
При замене субъединицы В на какой-либо другой лиганд токсин приобретает другую специфичность. Например, объединение в одном полипептиде субъединицы А дифтерийного токсина и меланоцитстимулирующего гормона а человека позволило создать препарат, токсичный для клеток меланомы (Мпгр(1у ег а!., 1986). Многообещающими в медицине благодаря своим разнообразию и специфичности могут стать иммунотоксины„представляющие собой иммуноглобулины, ковалентно связанные с полипептидными токсинами, Идеи белковой инженерии нашли свое воплогцение в современных экспрессионных векторах, например рсР(ЧА3.1 (см.
рис. 13.7). Они содержат комплекс дополнительных генетических элементов, позволяющих так направленно изменять целевой белок, что существенно облегчается поиск необходимых клонов (маркирование белка эпитопами) и очистка продукта (введение в белок высокоафинных к металлам сайтов типа Н(з, нли 3'-концевой полиаргининовой цепочки). Последняя придает белку основные свойства, что дает возможность хроматографически выделять его из суммарного белка. В образующихся белках предусматривают также сайты для отгцеплепия целевого белка от гибридного. .егскуссйаегеные бсггки. Основываясь на теории белковых структур„можно конструировать белки с новой, т.
е. не обнаруженной до сих пор в природе архитектурой. Первым таким белком стал альбебетин, состоящий из двух повторяющихся элементов се(313 (Финкельштейн и др., 1988). Его исследование показало, что практически он так же компактен, как и природные глобулярные белки сходной молекулярной массы, и имеет относительно стабильную структуру. Затем в него был введен биологически функциональный Фрагмент из восьми аминокислот, обладающий бласт-трансформирующей активностью интерферона (Долгих и др., 1993).
Модифицированный альбебетин имел высокое сродство к рецепторам тимоцитов мыши и активировал реакцию их бласт-трансформации даже эффективнее, чем интерферон. Глава 15 Молекулярноя биотехнология 447 Вакцииные препараты. Своевременная вакцинация защищает людей и животных от инфекционных заболеваний. Однако существует ряд причин, из-за которых далеко не против всех инфекций имеются надежные вакцины. Живые вакцины более эффективны, чем инактивированные, поскольку они размножаются в организме и включают все компоненты иммунной системы. Но лля этого не всегда удается выделить аттенуированные (с ослабленной патогенностью) штаммы, этому иногда мешает высокая антигенная изменчивость инфекционных агентов (вирус гриппа, ВИЧ), встречаются трудности их культивирования (вирус гепатита В) и т.
и. Поэтому ведется настойчивая работа по приготовлению генно-инженерных вакцин (см. обзор Оег1хбапйЬ, !998). Простейшим вариантом являются молекулярные вакцины, т. е. индивидуальные иммуногенные белки (например, поверхностные белки вирусов) и даже отдельные эпитопы (10— 15 аминокислотных остатков), синтезированные с помогцью методов клонирования и экспрессии. Действительно, по структуре гена в молекуле белка можно выявить непрерывные аминокислотные последовательности, определяющие его анти~ сивую активность. Многие вирусные белки и эпитопы были синтезированы и испробованы для вакцинации животных, по их иммуногенный эффект был слабым.
Более перспективным направлением оказалось использование живых вакцинных штаммов, как, например, БЦЖ (81овег ег а!., 1991), вируса осповакцины и аденовируса (см. гл. 13), с помощью которых клонировали и экспрессировали чужеродные для них гены иммуногенных белков. Можно упомянуть также опыты по использованию для этой же цели атгенуированного штамма Я. гурй1тиг)ит (Нас)се11, 1993), который, будучи пищевым патогеном, привлекателен тем, что может вводиться орально. Перспективным для целей иммунизации может оказаться метод фагового дисплея, позволяющий выставлять на поверхности вирионов целевые эпигоны (см.
гл. 10). Но настоящим прорывом являются ДНК-вакцины (см. обзор Дебабова, 1997). 448 Часть Ш. Экспрессия яуякероднььт генов Открытие факта иммуногенности рекомбинантных плазмид, кодирующих белок-антиген и введенных в организм просто внутримьпаечной или подкожной инъекцией, оказалось неожиданной удачей (%оИТ ег а1., 1990; Таня ег а1., 1992). Радикально упрощается методология иммунизации. Хотя при этом трансфицируется очень мало клеток, количество синтезированного белка оказывается достаточным для развития удивительно сильного иммунного ответа, гуморального и клеточного (()!щег ег а1., 1993; Рача, %Ба(еп, 1995).
Не требуется никакой адъювант, сама ДНК играет его роль. Каким-то образом синтезированные белки эффективно доставляются к антиген-представляющим клеткам. Если необходима комбинация нескольких антигенов, то достаточно при инъекции вводить смесь соответствующих рекомбинантных плазмид. Экспериментальные испытания на животных прошли ДНК-вакцины против гриппа, гепатита В и С, бешенства, туберкулеза, коклюша, вируса иммунодефицита человека и других инфекционных заболеваний. Преимушества ДНК-вакцин: 1) ими легче манипулировать, чем другими типами вакцин; 2) различные плазмиды, кодирующие разные антигены, готовят одинаковым образом; 3) из-за стабильности ДНК ее хранение и транспорт не представляют сложности; 4) существенно облегчается возможность модификации структуры белка-антигена, вплоть до встраивания в него гетеро- логичных эпитопов.
![](https://s.studizba.com/z.php?f=/templates/si/i/noavatar.png&w=100&h=100&t=1"){kind=avatar}
