Рыбчин - Основы генетической инженерии - 2002 (947310), страница 82
Текст из файла (страница 82)
Эксперименты по генной терапии рака более многочисленны, что вызвано распространенностью этого заболевания, возможностью манипулирования клетками пациента ех ига и этическими причинами, принимающими во внимание неизлечимость ряда случаев. Стратегия генной терапии рака зависит от молекулярной диагностики заболевания. Напомним, что известно лва класса генов, мутации в которых приводят к развитию злокачественных опухолей. Это нротоонкогены (их известно около сотни) и супрессоры опухолей (известны лесятки). В случае, когда опухоль была вызвана суперэкспрсссией онкогена К-ЯАо, ее лальнсйшсе развитие удалось предотвратить введением в клетки ретровирусного вектора, обеспечившего синтез антисмысловой (комплементарной) РНК к мРНК онкогсна.
Белок р53 подавляет развитие опухолей, а его дефектность вызывает рак. Ввелсние неповрежденного гена р53 в опухолевые клетки, дефектные ио гену р53, приволит к гибели этих клеток. Если причина заболевания неизвестна, то прибегают к генной терапии общего действия, положительный эффект которой хотя и заметен, но относителен. С этой целью используют интерлейкин-2 для повышения иммунного ответа или индуцируют гибель раковых клеток путем доставки к ним (в них) Фактора некроза опухолей ТИР. Из солидной опухоли пациента выделяют лимфоилные клетки ТН (гцпзог )пГ111га6пя 1упзрЬосу1ез) и с помоною ретровирусного вектора вводят в них ген фактора некроза опухолей Тйгг (Нзуц е~ а1, 1993) или интерлейкина-2, а затем после наращивания массы реимплантируют их пациенту.
Такой 428 Часть П1. Экспрессов чулсеввдвмх гвпвв же эффект достигается введением этих генов ех иго непосредственно в опухолевые клетки. Рев1ептор-оиосреооваииый перенос. Идея этого метода заключается в использовании специфики взаимодействия рецепторлиганд, присущей многим клеткам, для доставки в них терапевтических генов. Эти гены могут находиться в виде препаратов изолированной ДНК или быть в составе рекомбинантных вирусов или липосом. Например, лигандом для рецепторов гепатоцитов является белок трансферрнн. Изолированную ДНК в виде суперскрученной плазмиды '"пришивают" с помощью полилизина к лиганду и образовавшийся конъюгат инъецируют прямо в кровь, которая и доставляет его в печень. Рецептор "улавливает" лиганд, и ДНК-белковые комплексы поглощаются эндоцитозом (Сцпе! е1 а1., 1991; рис.
13.13,а). Однако при этом большая часть вошедшей ДН К деградирует в эндосоме. Для предотвращения этого процесса предложено использовать аленовирус, чьи белки способны разрушать эндосомы (рис. !3.13,б). С помощью специфических антител конъюгат можно присоединить к одному из поверхностных белков мутантного вируса, который не способен узнавать свой рецептор и размножаться, но защищает ДНК от деградации (рис.
13.13,в). Такой тройной комплекс будет специфически и эффективно доставлять гены в нужные клетки (М(Пег, У11е, 1995). Приведенный выше пример демонстрирует одну из возможностей изменять специфичность вирусного вектора путем присоединения к вириону дополнительного белка, узнающего клеточный рецептор. Другая возможность, реализуемая при работе с ретровирусными векторами, заключается в замене гена епг на одноименный ген родственного вируса или в направленной модификации этого гена с целью изменить его специфичность. Например, когда у вируса саркомы Рауса заменили 3'-концевую часть гена сит на ген гемагглютинина вируса гриппа, то он стал инфицировать человеческие клетки (Вопя е1 а!., 1992). Рекомбинантный белок Епт эффективно встраивается в вирион, обеспечивая поддержание новой специфичности.
Такой вектор потенциально полезен для генной терапии рака, поскольку способен осуществить инфицирование всех клеток ткани. Следует, конеч- Глава 13, Животные 429 но, добиваться, чтобы домены белка Епч, отвечающие за установление контакта вирус — клетка и поглощение вируса, не мешали функционированию друг друга. ,/ 1.ис. 13.! 3. Метод рецептор-опосредованного переноса терапевтических генов в клетки-мишсни с использованием изолированной ДНК и эденовируса: а — рецептор "улавливает" лиганд и весь ДНК-белковый комплекс поглощается эндоцитозом; б — эндопитоз аденовнруса и разрушение им эндосомы; о — эндопитоз копъюгата ДНК-лигапд-мушнтный элсновирус и его освобождение внугрн клетки Возможность адресной доставки терапевтических генов с помощью липосом зависит от многих факторов.
При введении в организм липосомам необходимо преодолеть его защитную систему, в частности, избежать поглощения макрофагами. Это в какой-то мере достигается добавлением в липидный слой отрицательно заряженных молекул, например полиэтиленгликоля. В яипидном слое должны также присутствовать вещества, способствующие их слиянию с клеточными мембранами, а также молекулы (моноклональные антитела, гормоны, ростовые факторы, вирусные белки), распознающие клетки-мишени.
430 Часть П1. Экгнрегсин чужеродньн ~гное Недостатком рецептор-опосрелованного переноса генов (как и всех методов трансформации) является временность экспрессии перенесенных генов, что заставляет прибегать к повторным процедурам генной терапии. Ткаиеспев!и4ическил эксврессия тиеравевтлических ге!и!в. Адресованности лействия терапевтических генов можно также добиться, поставив их под контроль тканеспецифических регуляторных элементов.
Число вь!являемых и используемых элементов увеличивается с каждым голом. К примеру, промотор гена креатинкиказы был успешно апробирован на мышах для ограничения экспрессии кДНК дистрофина скелетными и сердечными мышцами (Сох ег а1 „1993). Потенциально полезны промотор-энхансерные элементы генов иммуноглобулинов, специфичные лля В-лимфоцитов. Ведутся эксперименты по использованию способности ретровирусов развиваться только в леляшихся клетках, что может быть полезно для генной терапии рака. Например, клетки печени пролифирируют крайне медленно, и ретровирусный вектор в этом органе проявится только в опухолевых клетках.
Рис !3. !4. '*Идеатььмй" терапевтический вехтор. в — ней ммунагенная оболочка; б — лиганды лдя связывания с опрелеленным типом клеток; в — средство лля слияния мембран вектора и клетки; г— локусы лля направленной интеграции векторной ДНК в клеточную хромосому; д- промотор-энхансерный локус лля тканеспепифической экспрессии Глава 13. Животные 431 Оптимальный пгевапевпшчеекий векпау. Отметим еще раз, что векторы для доставки терапевтическим генов, которые были бы одновременно эффективными и специфичными, пока не созланы.
Теоретически такой идеальный вектор должен обладать: 1) стабильной неиммуногенной оболочкой; 2) специфическими лигандами для связывания с определенным типом клеток; 3) молекулярными средствами для слияпня мембран вектора и клетки; 4) способностью внелрять векторную ДНК в клеточную хромосому путем гомо- логичной или сайт-специфической интеграции; 5) регуляторным покусом для тканеспецифической экспрессии (рис. 13.14). ВОПРОСЫ ДЛЯ ПОВТОРЕНИЯ И ОБСУЖДЕНИЯ 13.1.
В чем заюпочаются преимушества исгюльзования эмбриональ. ных стволовых клеток при получении трансгснных животных? 13.2. Сравните различные методы трансформапии животных клеток, принимая во внимание их области применения. Метод микроиньекпии ДНК в ядра является наиболее эффективным; почему жс используют и другие методы? 13.3. Охарактеризуйте преимушества и недостатки вирусных и плазмилпых векторов. 13чй Какие элементы входят в эукариотичсскую экспрссспонную кассету? 13.5. Гсномный гсп встраивают в рстровирусный вектор.
Какова судьба интронов, содержащихся в гене? 13,б. Размеры ДНК некоторых вирусов, используемых в качестве векторов, прсвьппают 100 т.п.н., что затрудняет работу !л пгго. Какой прием используют для конструирования рекомбинантного вируса? !3.7. Состаяьтс план эксперимента по клонированию определенного животного гена с полющью вектора рс(З(чд3,1 (рис. 13.7), включая этапы по поиску необходимых клопов и очистки продукта. 13тй Объясните, в чем заключается феномен временной и тханевой специ4щчпости экспрессии у трансгенных животных, несущих индивидуальные чужеролные гены. 13.9.
Составьте ила~ ~ экспсрпмгяпа по замещению в животной клетке дсфскпюго гена на нормалгя~ый. Как убедиться, по замена проведена успешно? ! 3.!О. Сформулируйте проблемы, которые возникают при генной терапии человека. Какие подходы использую~ для их преодоления? ! 3.11. Почему вирусный способ поставки генов при генной терапии используют чаше друпзх, несмотря на его потенциальную опасность? Глава 14 ГЕНОМНАЯ ИНЖЕНЕРИЯ Согласно классификации, предложенной во введении, геномная инженерия решает проблему целенаправленной наследуемой перестройки какага-либо генома с тем, чтобы сформировавшийся организм существенно отличался па набору признаков от исходного, вплоть до отнесения его к новому виду.
В применении к плазмидам и вирусам речь идет об их проявлениях в клетке. Геномную перестройку возможно осуществить следующими способами: 1) внесением в геном значительного количества дополнительной генетической информации; 2) заменой существенной части генома на функционально гомалогичную часть другою генома; 3) модификацией ключевых генов с целью воспрепятствовать скрешиваемости с адновидовыми партнерами (для организмов, обладающих половым способом размножения).
![](https://s.studizba.com/z.php?f=/templates/si/i/noavatar.png&w=100&h=100&t=1"){kind=avatar}
