Рыбчин - Основы генетической инженерии - 2002 (947310), страница 80
Текст из файла (страница 80)
Среди них отыскивают, как описано выше, особи, у которых химерной является зародышевая ткань. Последующее скрещивание гетерози~ отных животных позволяет выявить гомозиготные особи по исследуемому гену. Ислользовалие глранспвзаюв. Перенос генов с помощью транспозонных векторов, как и в случае использования ретровирусов, имеет определенные преимущества. Здесь интеграция генов происходит с использованием сайт-специфических транспозаз, что предохраняет чужеродные гены от перестроек и делает экспрессию и регуляцию внесенных генов более контролируемой.
Впервые такой способ переноса чужеродных генов в зародышевые клетки был предложен для дрозофил (Яргайш8, Куш, 1982). Авторы использовали лля этой цели Р-элемент (см. рис. 2.6), делегирование центральной части которого не блокирует его способности к транспозиции в присутствии Р-элемента-помошника. Это позволяет внедрять в него фрагменты ДНК размером в несколько десятков тысяч пар нуклеотилов. Транспозазная активность Р-элемента проявляется только в зародышевой ткани и только, если в ее клетках нет резидентного транспозона (см. гл. 2).
Поэтому местом для введения генов был выбран постериорный 413 х1асть Ш. Экспрессия чужеродных генов конец оплодотворенной яйцеклетки на стадии после нескольких делений ядра, поскольку именно там формируется заролышевая ткань. Апробирование метода было проведено на мушках М-типа (в них Р-элемент отсутствует), гомозиготных по мутантному гену гоя. Особи с такой мутацией имеют коричный цвет глаз вместо красного, так как ген югу' колирует ксантинлегидрогеназу, участвуклцую в синтезе предшественника пигмента. Р-элемент был клонирован в плазмиде рВК322 (образовалась плазмида рп25. !), и в него был вставлен ген югу' (плазмила ргу- 1).
Обе плазмилы ввели в оплолотворенную яйцеклетку, гле Р-элемент мигрировал из плазмиды в хромосомные сайты, До половины мух, развившихся из обработанных эмбрионов, дали потомство с измененным цветом глаз Молекулярный анализ показал, что перенесенные сегменты ДИК с геном юху' (около !О т.п.н.) находятся в Р-элементах без каких-либо перестроек. ВВЕг'!ЕНИЕ ГЕНОВ В ТКАНИ И ГЕННАЯ ТЕРА!!ИЯ Проблема введения генов в ткани бьша поднята в связи с поиском подхолов к генной терапии человека.
Генную терапию определяют как перенос нового генетического материала в клетки индивилуума для достижения терапевтического эффекта. Таким образом, речь идет о лечении не только генетических, но и лругих заболеваний (рак, СПИД и т.п.), поэтому методы генной терапии различны. В случае генетических болезней генная терапия осуществляется путем введения нормального гена в ту ткань, где этот ген должен функционировать. Крайне желательно, чтобы введение сопровождалось замещением мутантного аллеля.
Однако технически зто пока не улается, и обычно добавленные в клетки гены функционирукл на фоне муганп!ых я силу своей доминантносги. Первый успешный опыт по переносу генов в клетки определенной псани был проведен с мьпцами (Сйпе ег а1., 1980). Авторы выделили из устойчивых к метотрексату мышиных клеток мультиплицированные гены гр)Г», ввели их в культивирусмые эритроилные клетки мыши и послелние трансплантировали в ткань костного мозга этой же мыши. Гены сУ~" экспрессировались в неи; уровень дигилрофолатрелуктазы в крови экспериментальных животных оказался в два-три раза вьпие, чем в крови контрольных мышей. Глава 13. Животные 419 Генетические болезни человека н генная терапия Описано уже около 5000 наслелсгвенных заболеваний человека, но только приблизительно лля тысячи из них найдены и картированы поврсждаемые гены.
Сведения о строении генома человека накапливаются в периолически обновляющейся энциклопедии Мак-Кьюсика. В 11-м излании приведены данные о 6678 картированных генах, из которых лля более чем 2800 определена их функция (МсКцз(ск, 1994). Дефекты в 770 генах вызывают моногенные заболевания (муковисцилоз, мышечная листрофия Дюшснна, фенилкетонурия, хорея Гентингтона, болезнь Гоше, ~емофилии А и В и лр.). Большая часть этих генов клонирована и ведется поиск методов их использования лля генной терапии.
Большинство генетических болезней являются полигенными (ап'.Росклсроз, рак, артрит и лр.). В этом случае предлагается не исправлять генетические лефекты, а вволить такие гены, которые ослабляют послелствия этих лефекгов. Например, генная терапия некоторых видов рака развивается по линии повышения иммунного ответа по отношению к раковым клеткам и по линии индуцирования гибели раковых клеток путем доставки к ним таких веществ, которые в процессе метаболизма образуют токсические лля пих молекулы (см.
с. 427). Вирусные инфекции могут рассматриваться как приобретенные генетические заболевания, поскольку некоторые из них (вирус Эпштейна — Барр, вирус гепатита В) могут вызвать развитие рака у инфицированных инливилуумов. Генная терапия таких людей может заключаться во введении в опрелеленные их ткани генов с антивирусным эффектом, чтобы прелотвратить их онкотрансформацию. Выявление таких тканей (клеток) определяет успех генной терапии.
К примеру, известно, что основной мишенью для вируса иммунолефицита человека (ВИЧ) являются СГ)4 лимфоциты, которые можно легко вылепить из организма, вводить в них нужный ген (например, антисмысловой РНК для вирусной мРНК) и возвращать обратно, Цель манипуляций — прслотвратить в клетках развитие вируса (явление предложено назвать внутриклеточным иммунитетом). 420 «1асть 1И. Экспрессия чужервднвгя генов Проблемы генной терапии человека На сегодняшний лень трудности в использовании методов генной терапии связаны скорее с клеточной биологией, чем с генной инженерией (рис.
! 3.) 2). Для получения терапевтического эффекта необходимо ввести гены в большое число клеток ткани-мишени, для чего более подходят методы ех у)уо (вне ткани). Однако типы клеток, которые можно извлекать, модифицировать ш уйго, культивировать и реимплантировать в организм, пока немногочисленны — фибробласты, лимфоциты, гепатоциты, кератиноциты, эндотелиальные и мышечные клетки, стволовые клетки костного мозга.
В реальности в клиниках пока экспериментируют с Т-лимфоцитами (острый комбинированный иммунодефицит„вызванный дефектом в гене АДА)„ гепатоцитами (семейная гиперхолестеринемия: дефект в гене рецептора липопротеинов низкой плотности), миобластами (мышечная дистрофия Дюшенна: лефект в гене днстрофипа)„фибробластами (гемофилия: дефекты в генах факторов 1Х или т'!11) и клетками эпителия бронхов (муковисцидоз: дефект в гене Сг-трансмембранного фактора).
Обратим внимание, что "здоровые" гены необязательно вводят в те клетки, где они в норме экспрессир)чотся. Например, факторы 1Х и т'!11 синтезируются в гепатоцитах, но в лечебных целях их гены вводят в фибробласты. В случаях, когда клетки с лефектным геном нельзя извлекать и культивировать, экспериментируют методами ьч угув (иньекции в ткань изолированной рекДНК, рекомбинанпюго вируса, липосом с ДНК). Методы гп уво, по-видимому, будут применяться и в экстренных случаях, когда лля использования методов ех у(уо пет достаточного времени.
Дополнительные ограничения вызваны, по крайней мере, двумя обстоятельствами. Во-первых, даже моногенные заболевания проявляются в нескольких тканях, а инженерия ех у(то развита пока для ограниченного числа тканей. Во-вторых, далеко не всегла при введении нормального гена устанавливается нормальная координированная экспрессия генов, участвующих в общем процессе, Р!апример, ген р-глобина успешно вводят в эритробласты Глава 1).
Живогинме 421 а) Ех с)та рсвиабииватииа, ~ - — рввдих вирус ф 4 в в и Ссвввиии ку рс Рис. 13.12. Две стратегии геиотерапии, введение терапевтических генов в клетки-мишени вие организма (а) или внутри организма (б) обработкой ех р)го стволовых клеток костного мозга и последуюпгей их реимплантацией в костный мозг, но сборка функциональных тетрамеров молекул гемоглобина происходит неэффективно из-за отсутствия координации с синтезом гх-цепи глобнна. 422 Часть В!. Экспрессах чужеродных генов Системы переноса генов Прежде чем приступать к генной терапии человека, каждая конкретная система (опрелеленные ген, вектор, ткань, способ ввеления вектора в клетки ткани и клеток в организм) лолжна быть апробирована в аналогичных условиях на животных.
Это необходимо лля того, чтобы убелиться, что новый ген можно вводить в клетки опрслеленпых тканей и что он сохранится достаточно долго, булст зкспрессироваться в клетках на необходимом уровне и не причинит врела (клетке или всему организму). В генной терапии главной проблемой при поставке генов является ее алресованность (перенос или экспрессия только в клетках определенных тканей), эффективность (ген лосгавлен в достаточное число клеток) и стабильность (гены должны функционировать у пациента достаточно лолгое время).
Системы, которые полностью отвечают этим требованиям, пока не созданы. Вирусльсй способ. Вирусный способ поставки генов эффективен в силу своей биологичности, поэтому около 80% испытываемых клинических протоколов основаньг на использовании ретровирусных или аденовирусныя векторов (см.
с. 403, 404). Эти векторы сконструированы на общем подхоле: вся или ббльшая часть колирующей послеловательности в вирусном геноме заменена экспрессионной кассетой. Манипуляции же с векторами производятся с привлечением специально сконструированных клеток, в хромосомах которых содержится информация„обеспечивающая репликапию векторных геномов и сборку вир ионов. Большинстворетровирусных векторов созданонабазе вируса лейкоза мышей (М1 Ч). Векторы, в которых сохранились только концевые повторы ).ТК и сп- действующие сайты Р, Ри и Ря'(см.
![](https://s.studizba.com/z.php?f=/templates/si/i/noavatar.png&w=100&h=100&t=1"){kind=avatar}
