Рыбчин - Основы генетической инженерии - 2002 (947310), страница 90
Текст из файла (страница 90)
С помошью программ выявляют необходимые атрибуты генов (промоторы и терминаторы транскрипции, сайты связывания рибосом„участки сплайсинга), что позволяет слелать увереннгяй вывод о наличии действуюших генов. Проведенный анализ представляют в виде физической карты, на которой указаны ОКЕ с направлением их ориентации и, когла возможно, промоторы и терминаторы транскрипции.
Анализ ствуктурьс генов и белквп. Выявленные структуры ге— нов и соответствующим им белков сравнивают с данными, хранящимися в мировых банках — ОепВапк (США) и ЕМВ1 (Германия). Задав, например, аминокислотную последовательность, можно с помощью пакета программ ВЕЛАЯТА сравнить ее не только с хранящимися в банках структурах белков, но и с потенциальными полипептидами, закодированными в нуклеотидных последовательностях. Найденнью гомологичные последовательности 472 Нрвло."хеение свидетельствуют об определенной степени родства генов (белков) и позволяют сделать предположения о функциях генов анализируемого генома. Серьезную помощь в анализе функций белков оказывает обнаружение в их структуре тех или иных "мотивов", т. е.
аминокислотных последовательностей, обеспечивающих определенные функции или служащие эпитопами. Поиск и анализ гомологий, идеальных и часгичных, играет важную роль в изучении эволюции на молекулярном уровне. Имеются алгоритмы сравнения определенной последовательности с одной или несколькими другими последовательностями и построения для них эволюционного древа. Существуют также программы, предсказывающие вторичную структуру однонитевых РНК или ДН К на основе знания последовательности оснований и с учетом термодинамических расчетов степени стабильности спирали.
Это особенно важно для выяснения функций регуляторных асРНК. Дшайн гибридизвциоииьп зондов. Гибридизационные зонды должны отвечать определенным требованиям: 1) длина от 20 до 50 нуклеотидов в зависимости от назначения; 2) содержание СС-пар около 50%; 3) отсутствие внутримолекулярных шпилек.
Программы дизайна зондов учитывают два возможных источника информации для синтеза праймеров — ДНК (или РНК) и белок. В обоих случаях задается интервал нухлеотидной или аминокислотной последовательности, и программа предлагает лучший вариант для этого интервала.
Из-за вырожденности кода зонд, синтезированный на основе данных по аминокислоцюй последовательности, не может быть полностью комплеменгарным отыскиваемой последовательности. В заданном интервале программа отыскивает участок, содержащий метионины н триптофапы (они имеют по одному кодону) и не включающий лейцины, серины и аргинины (они имеют по шесть кодонов). Как правило, программа предлагает вырожденные праймеры, отличающиеся друг от друга одним нуклеотидом. Вырожденные праймеры используются, когда неизвесгна точная структура отыскиваемой последовательности (поиск нового гена какого-либо семейства генов, поиск межвидовых гомологичных генов, известна только структура белка).
Прилож евое 473 Меры безопасности Генетическая инженерия с момента зарождения привлекла внимание ученых и широких кругов обшественности потенциальной опасностью некоторых исследований. Это опасение было высказано в 1974 году, вскоре после первых успешных экспериментов по получению рекомбинантных молекул ДНК методом и игго.
Группа известных молекулярных биологов во главе с П. Бергом призвала ученьгх к ограничению проведения ряла генно-инженерных экспериментов. Характер высказанных опасений был двоякого рода. Прежде всего указывалось на реальную возможность "утечки" клеток с рекомбинантными молекулами ДНК за пределы лаборатории или промышленных производств и, следовательно, угрозы внесения в организм человека или животных вредных чужеродных либо «собственных» продуктов (например, гормонов), но в неконтролируемых концентрациях.
А это, естественно, может привести к негативным последствиям, которые трудно предсказать. Во-вторых, отсутствие достаточных знаний о структуре и функциях генов, находящихся в клонируемом фрагменте ДНК, может привести к тому, что при внесении их в реципиентные клетки они начнут синтезировать не только желаемое вещество, но и какие-либо опасные пролукты (токсины, продукты онкогенов и т. п.).
В 1975 году данные проблемы обсуждались на Международной конференции, посвященной вопросам получения рекомбинантных молекул ДНК. В ней приняли участие ученые разных областей биологии (медицинской микробиологии, бактериальной генетики, вирусологии, эпидемиологии, биохимии, биофизики, ботаники, биологии развития и тш.), а также юристы, представители прессы, государственных и частных промышленных компаний. Участники конференции пришли к выводу, что эксперименты с использованием методов генетической инженерии должны продолжаться, но при обязательном соблюдении определенных правил и рекомендаций.
Эти правила были установлены в последуклпие годы в Англии, СССР, США, Франции и других сгранах. Неоднократно они пересматривались в сторону смягчения, так 474 /Удиломсеяие как постепенно накапливакппиеся данные свидетельствовали о неоправданной их строгости, особенно в отношении работ с традиционными лабораторными штаммами. В настоящее время в России работы генно-инженерного плана регулируются федеральным законом, пршгятым в 1996 г. Они подразделяются на два типа — ведущиеся в "закрытых'* или "открытых" системах.
В закрытых системах работы ведутся таким образом, что имеется химический, биологический или физический барьер между генно-инженерными организмами и окружающей средой. В открытых же системах такой контакт осуществляется 1например„культивирование гению-инженерных овощей). Работы в закрытых системах в зависимости от степени риска подразделяются на четыре категории. 1. Работа не представляет опасности здоровью человека.
Меры безопасности сравнимы с теми, которые установлены при работе с непатогенными микроорганизмами. 11. Работа прелставляет незначительную опасность здоровьк7 человека. Меры безопасности сравнимы с теми, которые установлены при работе с микроорганизмами, потенциально патогенными лишь при определенных обстоятельствах. ! Н. Работа представляет умеренный риск здоровью человека. Меры безопасности сравнимы с теми, которые установлены при работе с микроорганизмами, потенциально способными к передаче инфекционных заболеваний. 1Ъ'. Работа представляет значительную опасность здоровью человека.
Меры безопасности сравнимы с теми, которые установлены при работе с патогенами, вызывающими особо опасные болезни. На практике меры, обеспечивающие безопасность опытов с рекомбинантными молекулами ДНК, включают приемы, обычные в микробиологических исследованиях, а также меры по физической и биологической защите.
Под мерами физической зашиты понимается создание и использование специальных устройств, предотвращающих распространение биологических агентов в окружающем простран- Приложеиие 475 стве. Эти меры по своему характеру сближаются с мерами, действуюшими уже многие годы в медицинских, микробиологических и вирусологических лабораториях при работе с опасными микроорганизмами. Минимальный (Ф1) уровень физической защиты (работа без специального защитною оборудования) применяется в случае манипуляций с безопасными микроорганизмами. Низкий (Ф2) уровень физической защиты предусматривает более строгую изоляцию биоматериалов путем устройства боксов с отрицательным давлением воздуха и надежной герметизацией сосудов, содержащих рекомбинантные ДНК.
Средний (ФЗ) уровень физической зашиты необходим при зкспериментах с опасными объектами. Он достигается герметизацией всей лаборатории, но без ее изоляции от других помещений. При работе с микроорганизмами, особо опасными для человека, животных или растений, должен быть обеспечен высокий (Ф4) уровень физической защиты, для чего помимо выполнения требований уровня ФЗ лаборатории полностью изолирук>т. Для биологической защиты в зависимости от степени потенциальной опасности создаваемых рекДНК предусмотрены три уровня.
Уровень Б1 (наиболее слабая защита) обеспечивается при использовании клеток Е. со11 К-12 и векторов, полученных на основе неконъюгативных плазмид и бактериофагов, а также других клеток и векторов, обладающих сходной степенью безопасности. Уровень Б2 обеспечивается применением таких векторов и клеток, у которых вероятность перехода клонируемого фрагмента ДНК в окружающую среду составляет менее 10-". Уровень БЗ предусматривает использование систем вектор-клетка типа Б2, но испытанных на животных, включая и приматов, или апробированных в естественных экологических условиях.
Выбор уровня физической и биологической защиты зависит от меры опасности конкрепюго генно-инженерного зксперимента. Последняя определяется видовой принадлежностью клонируемой ДНК, ее длиной, степенью очистки, генетическими характеристиками и т.
п. Монографии и методические пособия Анализ гснома. Методы /Под род. К.Дейвиса.— Мз Мир, 1990, 243 с. 1снпая инженерия растений. Лабораторное руководство./Под рсд. Дж. Драйпсра, Р. Скотта, Ф. Армитпджа, Р. Уолдена. Мл Мир, !991, 408 с. Горбунова Б.Г/., Биранав В.С. Введение в молекулярную диагностику и гснотсрапию наследственных заболеваний. Санкт-Петербург: Специальная литература, 1997, 236 с. Девис Р., БатгтайнД, РагнДэк.
![](https://s.studizba.com/z.php?f=/templates/si/i/noavatar.png&w=100&h=100&t=1"){kind=avatar}
