Рыбчин - Основы генетической инженерии - 2002 (947310), страница 73
Текст из файла (страница 73)
Из молодых листьев утолят диски размером несколько миллиметров, стсрилизу!от их поверхность и инокулируют в жидкую среду, которая содержит агробактерии, несущие рекомбинантпые векторы. Прн этом происходит инфицирование растительных клеток, находящихся на краях диска.
После двух лией культивирования диски переносят на плотную срелу с карбенициллином (убиение агробактерий), канамицином (отбор растительных клеток, приобретших ген нео) и высоким содержанием цитокинина (индукция образования побегов). На этой среде сначала в отдельных местах по краям диска происходит образованис каллуса, из которого через 2-4 недели развиваются побеги (рис.
! 2.4,а). Затем каллус с побегом отделяют и переносят на среду с повышеш!ьгм содержанием ауксина„ипдуцируя образование корней. Через дополнительные 2 — 4 недели растение переносят в почву. При работе с новыми видами растений в прелварительных опытах, используя онкогенныс агробактерии, определянэт, какие эксплантаты подходят для таких опытов.
Ими могуг быть сегменты листьев, стебля, клубня, корня, черсшка, проро- Глава 12. Раонения 381 стка или размножаемые й) р(уго растения (рис. 12.4,б). Затем опыты повторяют с неонкогенными агробактсриями. Далее каллус или нити косматого корня переносят на плотную питательную среду и, меняя состав сред и условия культивирования, добиваются регенерации растений по схеме, предсгавленной на рис.
12.4,а. Листовые десен, нырнцнраванныс ыро(нлтсрнаьы ! 2-4нед ы( в; — ~ 1 калвусь!(' ' ~', 2.ананд.(~~а ф '~~ ) Карбенывсслль канамнвнн, Карбеннцвллнн, юиаизцин, выажое с<жсржввнс сытсылон в высокое содервсыие аувснна Инокулацнт Короне сенте галл (П) Косматьеа корень (ра) Кавлус (теовс ) Рис. 12.4. Способы трансфорлтации растительных клеток агробакгериями и регенерации растений: трансформапия листовых дисков (а) и трансформация среза растения (б) Клон трансформированных растительных клеток получают исходя из их протопластов.
Протопластирование является надежным методом получения изолированных растительных клеток. В подходя)пих условиях протопласт заново синтезирует клеточную стенку и вступаст в митоз (см. рнс. 5.4). Синтез ДНК служит сигналом о готовности растительной клетки к ее трансформации агробактериями. В этот момент, который наступает через недел)о после начала культивирования протопластов в жидкой среде, к ним добавляют агробактерии. После 1 — 2 недель дополнительного культивирования образовавшиеся в суспензии микроколопии растительных клеток (они после деления не расходятся) высевают на плотную селективную 382 Часть В1. Экспрессия нузкервднык генов среду. Через 3- б недель на чашках образуется каллус, из которого затем можно регенерировать целое растение. Именно такое растение будет трансгенным, если инфицируюгцие агробактсрии содержали рекомбинантную Т-ДНК.
Метод переноса чужеродных генов в растения с помощью агробактсрий не является универсальным. Основным недостатком является ограничение по кругу хозяев. Лишь в единичных случаях удавалось трансформировать однодольные растения агробактериями. Например, оказгеюсь возможным ицдуцировать образование коронч;ного ~алла у батата Рвлсогеа Ьи!Яега (однодольное растение), инфицироваиного клетками А. гигпе~аеГегв; у которых обласгь иг бьща предварительно индуцирована ацстосиришопами пораненного картофеля (двудольпое растение). Но проблема огрьч ~нчс~ гяя сааза~ ~а ~ ~е только с однодольпыми. Для многих видов культурных двудольных тоже пока не найдены условия их трансформации и/или регенерации целых растений из изолированных клеток. В таких случаях для трансформации используюг препараты изолированной ДНК.
Траие4ормаци» прото»ластова изолированной ДНК Впервые лостовсрная возможность химической трансформации растений была показана в опытах с двудольпыми. Их протопласты обрабатывали в присутствии полиэтилецгликоля выделенными Т1-плазмидами. После регенерации стенки клетки стали опухолевыми, а ДИК обнаружилась в ядрах, причем Т-ДН К оставалась в составе Т1-плазмил (Кгепз ег а!., !982). Этот результат позволил приступить к созданию векторов, предназначенных для переноса гснов в растения без использования агробактерий. Структура таких векторов сгандартна.
Оци содержат все необходимые элементы для манипулирования ими в клетках Е. сой, маркер для селекции растительных трансформантов и полилинкер (рис. 125,а). Особенно важно отметить, что эти векторы можцо использовгггь для трансформации протопластов как однодольных, так и двудольпых растений. Их небольшой размер (несколько т.п.н.) позволяет достигать достаточно высокого уровня трансформации (1О "' — 10 г) при ввелении рекДНК в протопласты с помощью полиэтиленгликоля, липосом и методом электропорапии. Апробирован также метод прямой микроиньекции рскДНК в ядра протогшастов.
Частоты трансформации при этом Глана 12. Ластнеиая 383 - ель велики 15 — 25 %), что отпадает необходимость в использовании селективных маркеров. Для зашиты ДНК от потерь во время манипуляпий в препарат иногда лобавляют инертную ДНК-носитель. Расппельный м а) елеидил в оастихельных влеглах Пслвадени зилование вселила в Б.сов Пелевина в Е.
сов Рис. 12.5. Строение векторов, предназначенных лля экспрессии генов в растительных клетках: а — принципиальная схема трансформирующего вектора; б — коннтегратнвцый зкспрессионпый вектор рЕОЪ"2381. МСЯ вЂ” цолилннкер; РА — сайт пслиаленнлирсвання Однако и метод трансформации протопластов изолированной ДНК имеет свои ограничения. Далеко не у всех лилов растений удается побиться регенерации клеток из протопластов, а у многих культурных видов регенерировавшие клетки не явля1отся тотипотентными, нозтому из них нельзя восстацовнть растение.
Тутгс4орлгаггия клеток и тки>сей изолирооагтоа ДхгК Растительные клетки имеют прочную стенку, и пока слинствепным универсальным способом ее преололсния является обстрел расли тельных тканей ускоренными микрочасгицами вольфрама, вылерьханными в растворе векторной ЛНК или РНК 1К!е1п ег а1, 1987). Этот метод успегшю применялся к различным типам клеток и разным тканям олнопольных и лвудольных растений. Достигнута и стабильная трансформация хлоропластов. Основной недостаток метолов трансформации с использованием изолированной ДНК вЂ” зто непредсказуемый характер ее интеграции в клеточный ~сном. Разрывы, перекомбинацин фрагментов и конкатемеризация трансформирующей ДНК происхолят гопазло чаше, чем ппи тпапсФормапии агпобактериями.
334 '1асть В!. зчкслрессях Юв!серадаагх седое Экспрессия чужеродных генов Какие гены восприпимшотся растениями как ч)'жеродные? Конечно, те из пих, регуляторпые сигналь! которых (промоторы, сайты сплайсинга и полиаденилирования) они не узнают. Это гены бактерий, грибов и животных. Растительные гены, как правило, точно транскрибируются и сплайсируются при гетерологичных переносах, но сушесгву!от достаточно серьезные барьеры межлу однодольными и двудольными растениями. Например, промотор гена гЬсб (см. с. 3116) пшеницы не функционирует в трансгенном табаке. Замена его вирусным промотором СаМЧ 355 обеспечила транскрипцию этого гена, но сплайсипг и полиаденилирование были некорректными. Использование кДНК вместо геномных генов устраняет только проблему силайсинга.
Элементы гена поз в качестве экспрессиопной кассеты были использованы уже в первом коинтегративном векторе рВСЧ2381, предназначенном для экспрессии клонированных генов (рис. 12.5,Ь). В нел! тандемом расположены начальная часть гена лоз с промотором и 5'-нетранслируемой последовательностью, а также его 3'-концевая часть, содержащая сайт полиаденилирования мРНК (Неггега-Ез!ге11а е! а!., 1983). Обе части разделяются в плазмиде единственным сайтом Вал!Н1, который и был использован для внедрения в плазмиду чужеродных генов. Прежде всего в него внедрили ген осз октопиновой плазмиды и перенесли в клетки А.
гил!супе!ей, солержашую плазмилу рТ(С5В. Образовавшиеся коинтеграть! (как это представлено на рис. 12.2) ипдуцировали в инфицированных растениях формирование корончатых галлов, которые синтезировали нопалин и октопин. На слелующем этапе с помощьк> того же вектора впервые удалось осуществить экспрессию чужеродного гена (са!) в растениях. В дальнейшем он же был использован для создания селективных маркеров для растений (яр!1, пргП, с!Ьгг). В зависимости от цели экспериментов экспрессия чужеродных генов может изучаться на уровне клеток или целого растения. Исследования на клеточном уровне часто проводят только лля тестирования созлаваемых векторных консгрукций, Глава !2.
![](https://s.studizba.com/z.php?f=/templates/si/i/noavatar.png&w=100&h=100&t=1"){kind=avatar}
