Рыбчин - Основы генетической инженерии - 2002 (947310), страница 69
Текст из файла (страница 69)
1!.4). В первом варианте повторы вводят в 360 Часть И1, Эксиресоия аумеродиыя гелос Каоиируемая ДНК $.:. $ ..' .$:...''.$. х Вектор м тн. Рекомбииааия Ы кыо .$ .. ° .$ '... х тн, м свн а) теь м сен О$ $' $:...:$ м тн. $ ' $ ) РеаДНК Кяоиируемаа ДНК $' '.$" $." '$. Ф ' '.$ ' .$': х ' х ' $ $: ! Веаоар м свн ~/ О ф Реаомбиаааия Ы тно $ $....$..:$:: $.:.
,' 1 РекДНК М сна та Рис. ! 1уй Схема линсйгюго (а) и кольцевого Щ ТЛН- клонирования. М вЂ” селективный маркер; Х вЂ” место кроссишовсра; зачсрнснныс участки — повторы а клонирусмой ДНК. Масштаб ие соблюден открытый конец плеч тАС-вектора, а во втором — в оба конца линеаризованного вектора типа г'Ср. В обоих вариантах отобранные по селективцым маркерам трансформанты содержали УАС, у которых средний размер вставки составлял !50-200 т.п.н.; их структурная и сегрегационная стабильность в обоих случаях была сравнилюй. Интересно отметить, иго эффективность клонирования нс зависит от присутствия в векторе покусов АЯо.
Их заменяют близкие им по строению локусы человеческой ДИК, встрсчаюгциеся в ней в среднем через 20 т.п.н. Глава ! ».,>(»>ожж»> Зб ! Кольцсвыс >'АС имсют ряд преимушсств перед линейными. Во-псрвых, они лсгко вылсля>отся из суммарной дрожжсвой ДНК, поскольку кольцсвыс молекулы задерживаются в стартовом положснии при гсль-электрофорсзе с пульсиру»ошим полем (см. приложснис). Во-вторых, они более устойчивы к разрывам при манипуляциях.
В-трстьих, введение в исходный вектор репликатора из Б-плазмиды позволяет псреносить УАС в клетки Е со(»', трансформируя их суммарной дрожжевой ДНК. ТА»(-кло»»ирова»»ис способно существенно ускорить выполненис программы "Гсном человска**. Напомним, что анализ гсномов начинается с создания банков гонов отдельных хромосом, выделение которых являстся очснь трудосмкой задачей. Оказалось, что с помощью ТАК-вектс>ров можно сслсктивно клонировать ДНК человска из суммарной ДНК мсжвидовых гибридов соматичсских к>»стт>к (см.
и». 5), содержащих олпу чсловсчсскую хромосому. Эта процедура позволяст обогащать чсловечсскую ДНК в 3000 раз. Болсе того, на примсрс гсна ВлС(2, мутации в котором с высокой вероятностью приводят к появлению рака л»олоч»»ой желсзы, была продемонстрирована эффективность ТАК-кло»»ирова»»ия и для выделсния спсцифичсских послсдоватсльностсй из геномной ДНК человека (!.ап»>пот е» а!., !997).
С этой цслью был сконструирован кольцевой ТАЙ вектор, который при линеаризации содсржал на одном концс промотор гена В)»СА2, а на другом — сго дистальную часть. Стандартныс опсрации кольцсвого ТАК-клонирования позволили за недш»»о работы впсрвые изолировать этот гсн из гсномной ДНК. В дальнсйшсм процелура кюнирования отдельных генов была упрошсна. Выяснилось, что для их вылсления из хромосомной ДН К на конце линсаризованного вектора достаточно иметь одну спсцифическую для гена послсдовательность, а на другом конце может располагаться повтор типа А!п (Копргша е! а(., (998). Рскомбинация происходит дажс при длипс концевых вставок, не превышаюшсй 200 п.н.
Такой подход, названный радиальным ТАК-клонированием, позволяет выдслять гены с прилегающими к нил» последователыюстями нсизвсстного строения с целью их дальнейшего анализа. Зб2 Часть П1. Экенрееенв ну»герое)ных генов тралслозониые векторы. Дрожжевой Ту-злсмекг (см. рис. 2.8, а), пе>мец>синь>й в какой-либо плазмидный вектор, яви>ется удобным инструментом лля хромосол>ной амплификапии чужеродных генов. С этой целью клонирусмый ген, который подчиняют дрожжевому прол>отору и в котором должен отсугствовать терминатор транскрипции, вставляют между 3 -концом открытой рамки считывания ТуВ и правым б-повтором (ориентация Ту-элемента задается направлением его транскрипции).
Такая конструкция. введенная в дрожжевые клетки, действует как амплифицирующая кассета, доставляя новь>е копии клонируемого гена в различные локусы генома (Вос)ее е> а!., !988). Эффскгив>юсть ~ранспозиции существенно повышается, сели заменить транспозонный промотор.
находяшийся в лсвол> б-повторе, на сильный дрожжевой промотор, например„гспа 6АЕ, (рис. 11.5). Рис. 11.5. Строение плазмиды, содсржюлей дрожжсвой .>ранслозоп- ньп> вектор Ту. и — транскрипт клонирусмого гена; б — >раискрип> Ту-злсмс».>а; с— прямые концевые повторы Ту-элемента; тройшая линия — клониру- смый ген Травсформация дрожжей Эффективным методом является введение плазмидной ДНК в протопласты. Их получают в результате удаления клеточной стенки с помощью В-глюкаиазы, причем в среде присутствует сорбитол для предотвращения осмотического шока протопластов. Далее протопласть> инкубируют с трансформируюшсй ДНК в присутствии полизтиленгликоля и хлористого кальция и вы- Глава 11.
Дрожжи 363 севают на твердые селекгивные среды, где происходит регенерация клеточных стенок и образование колоний трансФормантов. Вез полиэтилснгликоля, который способствует слиянию прото- пластов, трансФормация нс идет. Предполагается, что именно процесс слияния обеспечивает захват ДНК и его перенос внутрь клетки. Предварительное заключение ДНК в липгюомы и их слияние с протопластами приводит к увеличению эФФективности трансФормации. Возможна также трансФормация целых клеток, обработанных 0,1 М ацетатом лития, в присутствии полиэтиленгликоля.
Этот метод значительно проще, но эФФсктивность трансФормации на порядок ниже, чем при использовании протопластов. Широко используют и метод электропорации дрожжевых клеток. Экспрессия чужеродных генов в дрожжах Дрожжевые промоторы (см. рис. 1.8„0) существенно отличаются по строению от бактериальных промоторов. Различия в строении промоторов„а также сигналов сплайсинга (см. гл.
1) высших и низших эукариот нс являются принципиальными, но, тем нс менее, опи не взаилюзаменимы. Этим объясняются неудачи большинства опытов по экспрессии чужеродных генов с собственными промоторами в дрожжах. Г!оэтому для успешной экспрессии чужеродных генов в дрожжевой клетке их сигнальные последовательности, ответственныс за транскрипцию и трансляцию, необходимо заменять аналогичными участками дрожжевого происхождения. Для оптимизации экспрессии чужеродных генов в дрожжах необходимо преодолевать те жс препятствия, что и при их экспрессии в бактериях (см. гл. 1О). Однако па практике это сделать затруднительно из-за недостаточности знаний о причинах анализируемыхявлснии.
Например, время полураспада мРНК дрожжей варьирует в пределах от 1 до 100 мин, но причины разной их стабильности не известны. Столь же не ясна и ситуация со стабильностью бел ко в: предсказать, насколько будет стабилен чужеродный белок, заранее невозможно. Можно попытаться предотвратить деградацию нестабильного белка, 364 '1асть 111. Зкелреееил чу»серое>вьи генов сдслав его сскрстирус мы м, но это удается нс всегда, соли белок в норме функционируст в цитоплазмс. Часто белок гидролизустся в процсссс ого выдслсния из клеток блан>даря дсйствию протсаз, которыс освобождаьотся из разрушсьпьых всзикул. Этот эффскт можно прсдотвратип, используя бсспротсазныс штаммы дрожжсй.
Ужо отмсча>юсьь что эффсктивносгь трансляции зависит от структуры мР11К. В часпюсти, удалснис 5' и 3' нстраььслирусмых областсй мРНК коровою антигона вируса гспатита В позволило уь>сличить солсржанис этоп> бслка в клетке почти ьи два порядка (Кпьвксгп еь а!., 1986) при ььсизмсшюм содержании самой мРНК.
Но и здссь приходится дсйствовать мстодом проб и ошибок. Также известно, по и с и о л ь з о в а н и с оптимальных колонов должно привести к увеличению выхода чужсродноп> белка. Это было пролсмонстрировано на примсрс 50-кратного повьшьсния содсржания бслка при клонировании синтстичсского гона легкой й-цспи иммутиоглобулина льыши по сравнению с клонированисм сс кДНК (Ко(ц!а, Сиг(ик 1991).
Однако ость примсры и с другим рсзультатоьь. Экспрессия бактерььаль>ьььх генов. Как ужо говорилось (см. гл. 1), у эукариот в узнавании промоторов РНК-полимеразой важную роль играют тра> ьскрипционныс факторы. Сай'гы >шя них отсутствуьот в бактсриальных промоторах, ьюэтому они нс ь)>уьькььььоььалыььь в дрожжах.
В и> жс время лрожжсвььс промоторы зачастую функциоььальны в Е. еь>6. Впсрвыс это было показано в опытах по экспрсссии в дрожжах гона р-галакть>з>>лазы (Вовс е> л!., !981). Рис. 11.6. Строение плазмиды ркВ45, обсслсчивакалсй сиюаз гибридньло белка (>ь>ЛЗ-1аее". в клетках дрожжей (а) и Е. еой (а ь! О> В этих опьггах ььа базс всктора 'ь'Ер сконструировали плазмиду рКВ45, содержащую марксры АЕИ и ~l>ьАЗ (рис. 11.6). В ь сн 1/ЯЛЗ внсдри- Глава 11.,фомжи 365 ли гон /асХ без ссми начальных колонов. Гибридный гсн 1/ЛАЗ- й!сУ.
в бактсриальных клетках транскрибировался с промоторов гена Тс' и гена 6%АЗ, а в лрожжсвых клстках — только с зукариотичсского промотора. Гибридный белок проявлял 11-галактозидазную активность при синтезе в обоих типах клсток. Эксауессия генов жиоогпг!ых. Несмотря на то, что дрожжевыс клстки относятся к эукариотичсским организмам„функциональная экспрессия генов высших зукариот в дрожжах происходит значительно рсжс, чем бакгериальных генов. До сих пор успешно проведена только комплемснтация мутации АВЕЗ дрожжей соотвстствуюшим геном дрозофилы, который нс имсст интронов.
![](https://s.studizba.com/z.php?f=/templates/si/i/noavatar.png&w=100&h=100&t=1"){kind=avatar}
