Рыбчин - Основы генетической инженерии - 2002 (947310), страница 64
Текст из файла (страница 64)
10.3,а-1) или около 3'-конца (рис. 10.3, а-2) векторного гена. Первый вариант использу!от, когда целевой белок необходим в функциональной форме, Сайты интеграции располагакзт в самом начале векторного гс11а, чтобы колирусмая им )ь(-концевая часть гибридных белков содержала как можно меньше аминокислот.
Это, во-псрвых, даст шанс на сохранение в них биологической активности целевого белка, а, во-вторых, облегчает процедуру его отшепления и индивидуальной форме. Второй вариант применяют, когда для целевого белка нет способов тестирования (пет антител, субстрата и т.д.). В этих случаях за ним следят по активности (ферментативной или аптигснной) )х(-концевой части гибридного белка. Для такой цели, к примеру, разработаны векторы серии р()гь (рис. 10.4,6), в которых полилинкеры, расположенпыс в 3'-конце гена (асХ, обеспечивают считывание клопированного целевого гена в нужной рамке.
Гибридный белок обладает (з-галактозндазной и антигспной активностями, которые служат своеобразными маркерами (!аК, этикетка) состоявшейся экспрессии. Современные экспрессионные векторы, как правило, направлены на получение целевого белка в составе гибридного. Вспомогательная часть белка, которая может располагаться па )ч'- или С-конце, состоит обычно из трех элементов, обеспечивающих возможность: 1) очистки гибридного белка; 2) маркирования целевого белка (!абрпК); 3) отшепления целевого белка от гибридного. 334 Часть 1Ц.
Зкспрессия чужеродных гмюе Таблица ! 0.2 Фермгаггатпвпые и химические реагепты, используемые для специфического расщепления белков Расщепляемая последовательность Реагснт Х, Ъ' — любая аминокислота; ф — место расщепления белка; ' — рскомбинантный белок из каталитической субъединицы знтерокиназы быка.
Эффективность очистки гибридных белков достигается афин- ными методами вылеления. В векторе р13К ес обеспечивает В-галактозидаза, для которой такой метод разработан. Упомянем также белок тиоредоксин, состоящий из 108 аминокислот. Его присутствие в гибридном белке полезно по двум причинам. Вопервых, при суперэкспрессии он цахолится в клетке в растворимой форме и придает это свойство гибридным белкам. Во-вторых, дитиоловая группа тиорелоксина специфически связывается с фениларсином, что позволило разработать для него афинные сорбенты, активные и для гибрилных белков. Эффективен и поли! истидиновый тракт.
Белки, содержаьцие в своем составе последовательность из шести гистиднновых остатков гюдряд (Н!з,) обладают свойством специфически связываться с дивалентными катионами. Такие белки "вылавливают" на агарозном носителе, заряженном ионами пикеля !Ч!". Для отделения целевого белка от гибридного используют некоторые из приведенных в табл.
10.2 последовательностей. Уни- Трипсин 1!еигилаза нз ОавгнБит Субтнлпзпн Тромбин Фактор коагуляции крови Х,, Коллагепаза Знтероки паза Мах гм* Цианбромид Уксусная кислота Гидроксиламин -А п-1,Х-, -Еуа-.1Х-Агв-4.Х- -01у-А1а-Нм-Агб-фХ- -1.еп-Уа1- Рго-Агв-.1С~!у-$ег- -1! е-С !ц-Сг!у-лгб-з.Х- — Рго-Х-Ю!у-Рго- г'-!. -Аар-Аар-Азр-Азр-1 уз-4.Х- -Мег- ГХ-Азр4Рго-Аяп-! 01у- Глава !О. Бихтеряа 335 кальным оказался пептид Хргеззтм, взятый из продукта гена 70 фага Т7. Он обладает свойствами всех трех элементов, упомянутых выше. Он, во-первых, содержит тракт Н!ак Во-вторых, последовательность Азр-Еец-Туг-Азр-Лзр-Ахр-Лзр-(.уз является эпитопом (Ер!), для которого имеются антитела, что позволяет использовать его как экспрсссионный маркер.
В-третьих, часть эпитопа Лзр-Лзр-Лзр-Лзр-Еуз (сайт ЕК) распознается и расщепляется зптсрокиназой. Примером использования зкспрессионной системы Хргезз™ служат векторы серии рКБЕТ (рис. 10.4,в), предлагаемые фирмой 1пчгго8еп в наборе из трех плазмид (буквы А, В или С в названии). Они отличаются лруг от друга числом нуклсотилов в полилинкере МС8; правильность рамки считывания достигается в одном из них. Транскрипция внедренного через полилинкер целевого гена обеспечивается РНК-полимеразой фага Т7, геп которой, инлуцируемый добавлением !РТО, расположен в хромосоме клеток Е. со!! ВЫ!(ОЕ3) и нахолится пол контролем промотора !пс(Л~5 (8!ийег, Мо(уап, 1986; см.
табл. 7.1). Полученный гибридный белок затем афинно очипгают и обрабатывают энтсрокиназой лля получения целевого пролукта. При использовании схемы "б" образуется инливилуальный белок, но возникают трудности при оптимизации процесса трансляции (Я!оппо, 1986; см. с. 320). Их преодолевают, создавая специализированные векторы с олноцистронной (рис. 10.3, б-!) или лвуцистронной (рис. 10.3, б-2) конструкцией.
В последнем варианте первый цистрон обеспечивает оптимальные (природные) условия лля инициации трансляции, а трансляция второго цистрона сопрягается с трансляцией первого (8с!топег ег и!., 1986). Примером олноцистронной конструкции может служить вектор рАЯ! (рис. 10.4,г), сконструированный также на базе плазмиды рВК322. В пем элементы, контролируюшие транскрипцию (р1 „лиг(., ли!К и !К) и трансляцию (с1! ЯЭ), взяты из фага 7 (см.
табл. 4.1). Целевой ген присоелиняют к сайтам ВО (вылелено шрифтом) и КВБ (полчеркнуто) гена сП через ВатН!-сайт (курсив): Ме! ААОО АААТАС'ГГАСАТАТ ОСА ТСС 336 Часть 11!..Чксорессие чуя серодньт геяое Для этого после действия рестриктазы убирают выступающий 5'- конец векторной ДНК (например, нуклсазой 81) и образовавшийся ровный конец, который заканчивается инициируюшим колоном АТГЗ, лигируют со вторым колоном клонирусмого гена. Вектор рА81 поддерживают в клетках Е соВ МХ-1 (см. табл. 7.1), лизогспизованных дефектным профагом ).с!ге857, что позволяет регулировать транскрипцию клонируемого гена с промотора рЕ изменением температуры. Дополнительный контроль можно осуществлять цействием белка ),Ы (антитерминация транскрипции в сайте !К1; см.
гл. 4). Есть примеры векторов, позволяющих осущестгщять обе схемы клонирования. К ним относится серия векторов рЕТ (варианты плазмнды рВКЗ22), содержащие различные элеменп ~ гена Ву фага Т7: промотор, 1! первых его колонов, заканчивающихся ВатН1-сайтом, а также его терминатор транскрипции (КоьепЬсьй ег и!., 1987).
На рис. 10.4,д представлен вектор рЕТЗа, простейший из этой серии. Для получения конструкции, обеспечивающей синтез ипливидуального белка, целевой ген внедряют в №~е1- сайт (СА.~ТАТО), прсдшествуклпий ипициирующему коцону, для чего, конечно, предварительно модифицируют его начальную часть. Внедрение целевого гена через ВатН1-сайт позволяет получить гибридный белок. Векторы рЕТ продаются в наборе из трех векторов (буквы а, Ь или с в названии), отличающихся лруг от цруга числом пуклеотидов перед ВитН1-сайтом.
Правильная рамка считывания подбирается экспериментально. Транскрипция обеспечивается РНК-полимсразой фага Т7 в штамме Е. соВ ВЫ!(1)ЕЗ). Фагоаьей дисалей. Экспрессию клон ирусмых генов могут обеспе чивать, конечно, и фаговые векторы. Так, векторы 7.81!1 (рис. 7.6), АХАР и )ОКГ8 (рис. 7.7) используют с целью иммунологичсского скрининга гибрилных белков, если целевой ген вставлен в правильной рамке. По сравнению с плазмилными векторами, злесь фаги лополнитсльно выступают как средство для вскрытия клеток, делая лоступными внутриклеточные белки для применения антител. Неожицанной и плодотворной стала идея исгюльзовать фаги также с целью извлечения из клетки целевою белка или олигопептида путем его слияния со структурными фаго- Глава 10.
Биктерни 337 выми белками, в результате чего он оказывается выставленным на поверхности капсида (8ш1!ц, 1985; Рапп!еу, 8ш!!ц, !988). Зта техника получила назяание "фагового дисплея". Для "дисплея'* удобным оказался продукт гена Ш фага М13 (или Ы), который присутствует в 3 — 5 копиях на конце нитевидюй оболочки и обеспечивает адсорбцию фага на Р-шпи (см. гл.
4). !ч-конец белка 8р! П располагается на внешней поверхности оболочки, поэтому внелрение фрагмегпов ДНК, кодирующих короткие псптиды и даже целые гены, в 5'-кодирующую часть гена П!, приводит к появлению фаговых частиц, на конце которых "выставлены" посторонние для них цептиды или белки (рис. 10.5). Так, например, были сконструированы фаги, обладающие фосфатазпой активностью (МсСа((спу ег а1, 199!) и активностью трипсина (Согеу и а1, 1993). яя пе х 8рш 61 ! ярш "=7,-., ".7ь пей ж Рис. 10.5. Схема, гюясняющая принцип фагового дисплея с использованием гена Ш фага М13: а — элементы рекомбицаптного гена П7; б — фаг М13 с выставленными на конце пецтилами. р — промотор; 88 — сигнальная последовательность; арШ вЂ” продукт гена !!Г; > — ицициируюгций кодов; х — термицирующий колон Ограничением описанной системы является тот факт, что сборка фага происходит в процессе прохождения ДНК через цитоплазматическую мембрану, и поэтому с~руктурныс белки фага обладают свойством секретироваться.
Зтому нередко препятствуют посторонние аминокислотныс последовательности, внедренные в !Ч-конец белка 8рП1. Такое ограничение отсутствует у фага ), поскольку его сборка происходит в цитоплазме. Здесь оказалось возможным "выставлять" чужеродные белки и на поверхности головки (М(йатга ег а1., 1996), и на хвостовом отростке (Магцуата ег а!., 1994). В последнем случае воспользовались белком 8рУ„состо- 338 ь1аоть И!..знает>весах н>нее!>од>гых генов ящим из 246 аминокислот, из которых 70 на С-конце являются несущественными для жизнеспособности фага. Для конструирования подходящего вектора, названного Моо, 177-й кодон САС> гена )гбыл заменен сайт-направленным мутагенезом (см. гл. 8) на стоп-кодоп ТАС>.
![](https://s.studizba.com/z.php?f=/templates/si/i/noavatar.png&w=100&h=100&t=1"){kind=avatar}
