Рыбчин - Основы генетической инженерии - 2002 (947310), страница 59
Текст из файла (страница 59)
2), удобно использовать праймеры, ком>шементарцые концам транспозонов Гб)ай ег а!., 1988). Для этой пели используют метод полимеразного копирования с применением тсрмоциклеров Гсь>. приложение, раздел "Полимеразная цепная реакция") и термостабильных ДНК-полимераз (Гас), ">>епй Е)сер Не>й и др.; см. гл. 6). Этот метод удобен из-за возможности секвенировать двунитевую ДНК, чему способствуют повторяющиеся акты денатурапии анализируемого фрагмента и е> о гибридизации с праймером и вновь синтезированными фрагментами. Алализ больших пос»едоватедьюсглей.
Для установления последовательности нуклеотидов в больших фрагментах Д Н К !более ! т.п.н.) либо в целых геномах вирусов или плазмид требуется предварительная разработка стратегии секвенирования. Она сводится к выбору метода секвеннрования, способа фрагментации ДН К и способа восстановления полной последовательности нуклеотидов в анализируемой последовательности. Существуют две стратегии секвенирования — направленный н случайный (з)>о!-8>>п) анализ. В обоих подходах большую нуклеотидную последовательность расщепляют на более мелкие фра>— менты и секвенируют их.
В первом случае очередность фрагментов должна быть известна, а во втором — нет. В случае направленного анализа вначале состав;икзт физическук> (рестрикцио»ную) карту анализируемой области, т. е. определяют взаимное расположение сайтов узнавания различных рестриктаз и примерные расстояния между ними.
Затем на основании полученных данных подбирают комбинации рестриктаз для образования таких фрагментов, которые бы имели определенный размер и перекрьпали всю исследуемую область. Эти фрагмегпы секвепируют, после чего восстанавливают полную нуклеотидную последовательность области, пользуясь ее рестрикционной картой. 308 Часть 11. ТС55лл5! 555555геледлл 5л г5ггг5 Данный способ можно примсщггь для областей ДНК, не прсвышаклцих цо размеру нескольких тысяч пар нукяеотидов. При больших размерах молекул ДНК возникактг технические затрулнсния, поскольку составление физических карт, выделение и клонирование многих определенных фрагментов является трудоемкой задачей.
Поэтому прсьзюжсны раз55ичныс методы образова55ия набора лелсций, которые начинаются в общей точке и простираются в анализируемую область на разную длину. Это позволяет не проволить ее физическое картировацис и ссквенировать ее с использованием об!пего ираймсра.
Наиболес практичен метод с использованием экзопуклеазы Ш, описанный в гл. 8 (см. рис. 8.11). При втором подходе вначале анализируемую ДН К дробят случайным образом (ультразвук или ДНКаза 1 в присутствии ионов Мп" ) до образования фрагментов размером не более 500 пн., а затем получают из них клоно5еку, представляющую всю анализируемую область.
После этого из клслютски наугад берут клоны и ссквенируют их (как правило, по Сэнгеру). Данные анализа отлсльных фрагментов 5гакапливщотся в компьютере (см. приложение) и группируются в контиги — 5руппы из нескольких последовательно соединенных ссквснированных участков (8!аг(еп, 1986). В процессе работы конт иги наращива5отс5! по длине и постепенно объединяются, а число разрывов между ними уменьшается.
Эта процедура позволяет достаточно эффективно опрслслить последовательность нуклеотидов в значительной части всего генома (около 80 %), после чего резко возрастает число ссквснирований, дающих уже известную информацию. Поэтому далее целенаправленно методом гибридизации отыскивают клоны, содержащие еще не проанализированные после55ователы5ости. Подход основан на том факте, что последовательности нуклсотидов в блоках перекрываются. Это дает Возыож!юсть использоВать В ка~!сстве 3055дов дл5! поиска ОтсутстВующих клонов тс клоны, на которьгх прервался анализ последовательности нуклеотидов. Восстановление полной нуклеотидной последовательности и ее анализ осуществляют с применением ЭВМ.
Данный способ незаменим для секвенирования областей ДНК„ размер которых превышает 10 т.п.н. В этих случаях получают субююны фрагментов ДНК размером 3 — 5 т.п.н., каждый из которых ссквснируют по отдельности. Именно так впервые был секвенирован целый геном — ДНК фага )., содержащий 48502 п.н. Глава 9. Авализ гевов и гевомов 309 (Яапйст в! и1..
1982), па что ушло болсс гола работы целой лаборатории. Г(а конец 1998 гола известна нуклсотидная послсдоватсльность у 317 вирусов животных и расгсний и 43 бактсриофагов. Секвепироваиие клепючньп генппов. Разработка автоматических ссквснаторов сущесгвснно ускорила процссс анализа послсдоватсльностсй и позволила приступить к ссквснированию клстпчных гсномон, для к<лорых прсдваритсльно составляют физичсскис карты. Как правило, сскнснируют по отдсльности Фрагменты гсномной Д НК размсром 40 — 200 т.п.н., клонированныс с помошью космид, Л-вскторов, а также векторов типа т'АС, ВАС или РАС (см. с. 271).
Для этого ДНК каждой вставки лробят случайным образом и субклоны ссквснируют наугад. Далее составляют контиги, объсдинс«ис которых завсршаст анализ фрагмента. Послсдоватсльная "привязка" фрапигяпон к физичсской карге генома позволяет коь<тролиронагь процесс ого сскнснировзн<вь Ужс известна полная пухла<пиеа<ах последовательность нескольких клсточных геномов: у архсй — Агсйаео81оЬив Ги(8!Ат (2,3 млн.п.н., К1сп!< е! а1., 1997), МегйапоЬасгеПит глепвоаигоггорЬ<сит (1,8 млн.п.н., Вплтй е! а!., 1997), Мерйапососсив !аппавгЬВ (1,7 млн.п.н., Вц!1 е! а!., 1996), РугоЬаси!ит аегорЫит (1,8 млн.п.н., пс опубликовано), Ругососсив 1иг!оя<в (2,1 млп.п.н.„нс опубликовано), Ругососсив !<ог<7<охй(!(1,7 млн.п.н, Кат<агаЬауая( е! а1., 1998); ТЬегтого8а таПита (1,8 млн.п.н., нс опубликовано); у бактерий — А<!и(Тех аесойсих (1,5 млн.п.н., Рос)<сгг е! а1., 1998), В.
виЬг!1!в (4,2 млн.п.н., СспВап1<, 1997), В. !я<<8<!о~Хег!(1,3 млн.п.н., Ргазсг е! а1., 1997), СЬ!итугйа !гас!<атолл (1,0 млн.п.н., Втор!зспз е! а1., !998), 12е<пососсивга<!!ог(агапа (3 млн.п.н., нс опубликовано), Е. соВ (4,6млп.п.н., В!аппсг е! и!., 1997), НасглорИ«в !п()иеп2ае (1,8 млн.п.н., Г(с(яс)цпапп е! а1., !995), Не11соЬасгвг ру1оН (1„7 млн.п.н., Топ<Ь е! а1.,1997), МуеоЬасгелит п<Ьвгси1опх (4,4 мш< па<., Со!с е! а1, 1998), Мусор(тога 8еп!!а1!иел (0,6 млн.п.н., 1-<ахсг е! а!., 1995), Мусор!а<та рпеитотае (0,8 млн.п.н., Ейгпгпс!го<с!з ег а1., 1996), В!сйе!!в<а ргогеа~еЛ!! (!,! млн.п.н., Ап<1сгвгюп ег а!., 1998), Вгпес!<осувг!в РСС6803 (3,6 млн.п.н., Капс1<о ег а!., 1996) и Тгеропети ра!1<<!ит (1,1 млн.п.н., Ггаясг е! а1., 1998); у зукариот — Х сегеияае (12,0 млн.п.н., Г)ойеац ег а1., 1996), Саспог)<аб<111(в с!сйапз (100 млн.п.н., 8с(спсс, 1998).
3!0 Часть Кч Генная ияжеяерля Гп иГто Следует отметить важность секвенирования генома И лгбегси)ояй, поскольку туберкулез но всем мире принял эпидемический характер из-за растущего числа антибиотико-устойчивых штаммов. Каждый третий человек инфицирован этими бактериями, и у каждого из них сеть 10%-ая вероятность того„что болезнь перейдет н клиническую форму. В 1997 году от этой болезни умерло около 2,9 миллиона человек. Есть надежда, что проведенный анализ позволит разработать более эффективные средства против этого микроба. О масштабе работы можно судить на примере секвенирования ДНК М7двлахеЬй.
Зги анаэробные архсбактсрии выделены с глубины 2600 м, где давление достигает 200 атм, а температура 90 "С. ДНК размером !660 т.п.н. содержит лишь 31,4 % ОС-иар, в ней было выявлено !738 открытых рамок считывания. Ссквсиироваиие проводили методом случайного анализа вставок (средний размер 2,5 т.п.и.), клоиироваиных в плазмидных векторах.
В одной реакции определяли в среднем последовательность из 48! иуклеотида, а всего было сделано 36178 анализов. Коитиги формиронали с помощькз банка генов, полученного с использованием фа~ а ),. Еще более впечатляет работа по ссквеиированию генома дрожжей, в которой участвовало около 600 ученых. Последовательность из 12 мли.п.и. была установлена за 5 лет, включая время иа конструирование днух независимых космидных библиотек (энциклопедий) дрожжевых генов.
Компьютерный анализ позволил установить функции почти половины из 6000 выявленных дрожжевых белков, причем большинство из них были в той или иной степени го мол о~ ию ~ы человеческим белкам. Наконец, подчеркнем значимость завершения 15-летией работгя ио секвсиированию первого живопюго генома — исматоды С. е!еяиля„ резульзш ам которой посвящен спсциальиыи выпуск журнала Яс!спсе (Вс!епсс, !998). Этот круглгаи червь длиной около 1 мм состоит из монсе, чем тысячи клеток, ио его биология основа~та на общих лля животных принципах.
Он также развивается от зародыша до взрослого организма, имеет кишечный тракт, нервы, мышцы, кожу. Его геном состоит из 100 млн.п.и., причем около 40 % его генов сходны с генами млекопитающих. Поэтому сравнение его генома с человеческим позволит илсгпифициронагь родственные гены, опрслелить их функции у нематодгл и„таким образом, сделать выводы о функциях Глава 9. Аььсоьиз генов и геномов 311 соотвстствующих человеческих гонов, По этим данным можно понять причины мнопьх наследственных заболсваний.
![](https://s.studizba.com/z.php?f=/templates/si/i/noavatar.png&w=100&h=100&t=1"){kind=avatar}
