Рыбчин - Основы генетической инженерии - 2002 (947310), страница 61
Текст из файла (страница 61)
В табл. ! 0.1 перечислены некоторые промоторы, используемыс для экспрессии чужеродных генов в клетках Е са11, и указаны способы регулирования их активности. Из них наиболсс часто прИменяются промоторы Хр!., !асЬУ5 и ггр. Их выбор был обусловлен частично историческими причинами, а также их силой и способностью к индукции. Г!омимо этого оказалось важным, насколько промоторы неактивны в репрессированном состоянии. Дело в том, что некоторые белки (например, инсулин) токсичны для бактериальных клеток, поэтому клонирование соответствующих генов с целью их дальнейшей экспрессии невозможно при использовании конститутивных илн слабо регулируемых промоторов.
Для практического применения также важно, насколько экономичен способ индукции. Таблица 10.! Промоторм, используемые в векторах для кяоннроваггнв в Е. са11 * Под контролем тсрмочувствнтсльного рслрсссора ХС!857. в* Рскомбннатныс нромоторы: — ! О от р1ас13тг5, — 35 от рар; отличаготся одним нуклсотилом мсжлу боксалги. В большинстве генно-инженерных конструкций промотор 7 р!. регулируется термочувстнитсльным рспрессором С1857. Для полной репрессии гена, находящегося под контролем этого промотора, при 28 "С достаточно олной копии гена ) с1, даже если 318 Часть 1В.
Экенрееенн нужервдньгх генов клонируемый ген присутствует во многих копиях. Эффективным и достаточно дешевым способом индукции является нагрев культуры ло 42 "С. Однако приходится учитывать, что при этом индуцируется синтез белков теплового шока, один из которых, нротеаза Еоп, расщепляет чужеролпые белки (см.
далее). Этой неприятности можно избежать, ис|юльзуя мутант по гену «роН, который контролирует транскрипцию гена !ол. Более радикально эту проблему предлагается решать с помошью промотора, индуцируемого добавлением поваренной соли (Впапе)аг1, Оотгпз! 1апкаг, 1997). О лостато ню сложной системе регуляции транскрипции оперона йр говорилось в гл. 1, Апенюатор (см. рис.
1.5) вносит лишь неболыпой вклад в репрессию оперона, поэтому в экснрессионных векторах промотор ггр содержит сайт ВВБ лидерного пептида, а сама лидерпая часть оперона отсутствует. Регуляция генов в полобных консгрукциях происходит нормально в присутствии олной копии гена ггр((. Мутантный промотор !ае(!'у5 сильнее промотора дикого типа и гораздо менее чувствителен к катаболитной репрессии глюкозой. Это важно в прикладных целях„поскольку глюкоза — самый дешевый источник энергии при ферментапии. На базе этого промоторя сконструированы промоторы гас и ггс, в которых область — 35 взята от промотора лр.
Искусственные промоторы оказались в одиннадцать раз сильнее промотора lае(Л*5 и в три раза сильнее промотора лр. Если промоторы !ае(Л~5 и ггр находятся в мультикопийных векторах, для полной репрессии клонируемых генов необходимо использовать мутантный аллель гена!ае! — )асН, продупнрующий в деся~ь раз болыле Бас-репрессора. 2. Наличиетерми нато ра транс крин ци и вконце чужерошюго гена — фактор скорее желательный, чем обязательный.
Излишняя ллина мРНК может способствовать образованию такой втори шой структуры, которая будет препятствовать ее успешной трансляции. Волна транскрипции чужеродного гена не должна также захватывать локусы вектора„отвечающие за его стабильность. 3. Присутствие в оперонах слабых внутри генных т е р м и и а т о р о в т р а н с к р и п ц и и способствует поддержа- !лава !О. Бакверии 3!9 нию в клетке необходимого числа транскриптов. При конструировании продуцентов этот фактор может стать лимитируюгцим для получения нужного уровня синтеза белка.
4. Число плазм илных копий у.Е го!! может варьировать от ! до 2000 на клетку. Однако количество белка, синтезируемо!о под контролем плазмиды, увеличивается линейно с повышением числа копий лишь до нескольких лесятков или сотен молекул на клетку. Оптимальное число копий вектора в клетке определяется главным образом природой синтезируемого белка и особенностями используемого промотора. Кроме того, необходимо учитывать, что повышенное число копий гена и в связи с этим максималыю возможный синтез чужеродного белка полезны только на конечной стадии культивирования продуцента, поскольку на ранних этапах и то, и другое серьезно увеличивает время культивирования и снижает выход продукта. Поэтому желательно предусмотреть в экспрессионном векторе возможность контроля копийности.
В случае токсичных для клетки синтезируемых продуктов удобно использовать термочувствг!тельные гвп-аиау мутации (см. гл. 3), которые при 42 'С увеличивают число копий плазмиды до 2000 и вызывают гибель клеток. Такие гены помеща!от под промотор ) р(., регулируемый термочувствительным репрессором С)857, который при 28 С надежно блокирует, а при 42'С индуцирует экспрессию гена. В случае нетоксичных продуктов оптимальное число копий цлазмиды определяется выбранным промотором. Например, в векторе рВВ322 при обычном числе его копий (20 — 60) хороший выход продукта обеспечивают промоторы ).р(, (ас()Ч5 и йр.
В то же время применение его копийных ыута~!тов (до 300 копий) приводит к повышению выхола продукта только при использовании промотора lас()У5, поскольку при этом экспрессия гена не подавляется интенсивной репликацией. Повышение числа копий вектора приводит, конечно, к увеличению выхола и плазмидо-специфических белков, некоторые из которых при высоких концентрациях могут дестабилизировать плазмиды. К таким относится, например, продукт гена Тех. 320 Часть 1! 1. Зхепрееепя чужеродпыт еепав 5. Эффект увеличения уровня транскрипции генов в суперспирализованной ДНК по сравнению с релаксировапной отмечался во многих случаях (Сейег1, 1981).
Повидимому, это связано с лополнительным энергетическим вкладом суперспирализации в открытие комплекса РНК-полимераза: промотор. 6. Расположение чужеродного гена по ходу движения репликативной вилки позволяет избегать негативных последствий столкновения волн транскрипции и рспликации. 3рооеиь РНК. На этом уровне эффективность экспрессии зависит: 1) от структуры сайта связывания рибосом (КВ8); 2) стабильности транскрипта; 3) на:пения в мРНК оптимальных кодонов.
1. Эффективность трансляции мРНК прежде всего зависит от структуры КВБ. Как уже отмечалось в гл. 1, этот сайт вювочает в себя Яэ-последовательность (как минимул~ любые подряд четыре нуклеотида из последовательности АССАСС) и инициирующий кодов (АСС гораздо более эффективен, чем СНС или (эНС); его типичнос строение — АССА(Ч,,АЬС. Промежуток между Я) и АСС насыщен нуклеотидами А или 1.1, причем в положении -3 от ицициируюп!его кодопа преобладает А (Яоггпо, 1986). Некоторые гены обладают дополнительной к Я3 последовательностью, которая играет роль трансляционного энхансера.
Так, в лидерной части мРНК гена 10 фага Т7 энхансером является 9-звенный сегмент 5'()ПАЛС(ЛЛ'АЗ', предположительно взаимодействующий с участком 458-466 168 рРН К Е со(! (01шз, Капйтпа1а, 1989). Его внедрение перед геном !асХ позволило увеличить синтез р-галактозидазы более чем на порядок. Реальное строение КВ8 инливидуально для каждого гена, существенно отсутствие в лидерной части мРНК шпилечных структур, затрудняющих посадку рибосом. Поэтому часто в КВ8 входит и несколько начальных колонов гена.
Статистически значимо, что вторым колоном является СС() или ААА, а четвертый и пятый колоны содержат последовательность С()АА (Яоппо, 1986). Важно также и расстояние между 5'-концом мРНК и Я)-последовательностью, которое не должно быть менее 15 нуклеотидпых остатков. Глава 10. Биклмрии 321 Приведенные данные касались клеток Е го(1. Как выяснилось, сходный механизм инициации трансляции используют и другие бактерии, включая грамположительные клетки. В час~ности, ЯЭ-последовательности у В. 5иййз и Е со(1 очень близки, но бациллярные более специфичны. Это объясняет, почему рибосомы Е.
го(1 транслируют бациллярные мРНК, а обратный процесс не происходит. 2. Проблема стабилизации транскрипта вызвана тем, что нестабильность мРНК у прокариот — это эволюционно выработанный механизм их быстрой адаптации к изменяющимся условиям. Их инакгивация, измеренная по потере массы или функции, происхолит по экспоненциальной кипетике. Каждая мРНК характеризуется собственным временем полураспада, в клетках Е. го(1 эта величина лежит в пределах от 30 с до 8 мин при 37 ' С. Рибосомы зап1ищают м1'НК от деградации, поэтому наиболее частой мишенью для энде- и экзонуклсаз являются цетранслируемые 5'-концы транскриптов (своболные транскрипты расщепляются экзонуклеазами и с 3'-конца). Именно от особенности их строения (расстояние от 5'-конца да ЯЭ-последовательности, наличие шпилек, частота посадки рибосом и т.
п.) зависит главным образом скорость их распада. Однако какой-либо консервативной последовательности здесь не обнаружено. Есть только олин пример успешной "пересадки*' лидерной части стабильного транс- крипта. Стабильность транскрип па гена 32 фага 34 обеспечивается благодаря специфическому сайту перед инициирующим колоном н его защите фаговым белком. Это свойство удалось придать в генно-инженерных конструкциях некоторым бактериальным мРНК, но эффект наблюдался только в присутствии указанного белка. Поэтому он не нашел широкого применения.
3. Напомним, что большинство аминокислот кодируются более чем одним кодоном и что разные виды клеток имеют собственный набор предпочтительно используемых (оптимальных) колонов, который коррелирует с количеством содержащихся в клетке изоакцепторцых тРНК (см. табл. 5.1).
![](https://s.studizba.com/z.php?f=/templates/si/i/noavatar.png&w=100&h=100&t=1"){kind=avatar}
