Рыбчин - Основы генетической инженерии - 2002 (947310), страница 56
Текст из файла (страница 56)
Это свилетельствуе г о присутствии в атом переваре двойного количества таких рестриктов. Общее число рестриктов (5=2-ь3) говорит о циркулярности плазмилы. Легко устанавливается, ч1о болыпий К1 рестрикт расщепляется на 3 фра> мента (9=5,5+2,5+1,0), а меньший — на два а) кг кг к!кг М О 3 б 9 12 тпзь Рис. 9.7. Физическое картирование ДНК леетодом двойного перевара рестриктазами. Представлены злектрофореграммы одиночных и лвойных псреяаров ДНК ресгриктазами К! и Вгдлл лвух препаратовДЕ!К. Результаты анализа представлены в аиде карт кольцевой (и) и линейной (б) ДНК К1 К2 К1-Н~г 5Д ,1О 1О ) 1 ь ябна К! 12™л з '1 И Кг И+И 1б5 ~Ы.Ы ~ .'ь !го ) 1О,1О ~ Глава 9.
Алализ гелов я геномлв 291 (3,0=2,0+1,0). Болыпий В2 рестрикт расщепляется на фрагменты 6„5=5,5+1,О, а средний — на фрагменты 4,5=-2,5+2„0. Отсюда ясен порядок следования рестриктов лвойного перевара (2,5- 1,0 — 5,5— 1,0 — 2,0; от начала координат по часовой стрелке) и самих сайтов рестрикции (К1-В2-К2-К1-К2). Ле~ ко подсчитываются и расстояния между этими сайтами.
В варианте "б" аналогичные данные и те же аргументы свидетельствуют о линейности анализируемой плазмиды (при лвойпом переваре число рестриктов меныпе суммарного числа рестриктов при одиночных переварах). Несложные рассуждения позволяют установить, что в данном случае препарат ДНК представляет собой ту же плазмиду, но линеаризованную через К1-сайт в начале координат. Порядок рестриктов у линейных молекул ДНК можно установить также, анализируя результаты частичного перевара ДНК, если предварительно идентифицированы концевые рестрикты. Концы молекул метят каким-либо способом до их обработки рестриктазами, а затем после разделения ресгриктов гель-электрофорезом выявляют концевые фрагменты с помощью авторадиографии.
Для картирования сайтов рестрикции в чужДНК„ клоцированной в каком-либо векторе, можно использовать свойство нуклеазы Ва131 укорачивать в регулируемых условиях дуплексы ДНК с двух сторон (см. гл. 6). Для этой цели необходимо предварительно линеаризовать рекДНК через сайт на стыке чужДН К и вектора. Далее из реакциошюй смеси, содержащей эту ДНК и нуклеазу, через опрелеленные промежутки времени отбирают пробы, обрабатывают их заданной рсстриктазой и полученные рестрикты анализируют гель-электрофорезом. По мере действия нуклеазы рестрикты исчезанп в том же порядке, в каком они находятся по отношению к концам линеаризованной рекДНК.
Задача решается однозначно, поскольку порядок сайтов рестрикции в векторе заранее известен. Суммирование ллин фрагментов, полученных с использованием разных рестриктаз, должно пать близкие значения. Заметное отступление какого-либо отлельного результата от срелней величины свидетельствует о наличии мелких неидентифицированных фрагментов или о совпадении электрофоретических подвижносзей у разных фрагментов. Мелкие фрагменты можно выявить на 292 '1асть 11.
Генная инаеенерия и~ нна авторадиограмме, осуществив концевое меченне ДНК после действия рестриктазы и используя более плотный гель (см. приложение). Совпадение длин у двух разных рестриктов приводит к более интенсивной прокраске их общей зоны на электрофореграмме. Для картирования часто встречающихся сайтов рестрикции использукзт другие методы. В одном из цих проводят мечение только одного конца молекулы ДНК и обрабатывают ее рестриктазой в таких условиях, когда молекула расщепляется только в одном сайте, При агом в пробирке образуется набор фрагментов ДНК, длины которых отличаются друг от друга только на размер одного рестрикта (рис. 9.8). Порядок сайтов рестрикции и расстояние между ними можно оценить по анализу авторадиограммы селя.
А в с и д в Т . ФУ .. Ъ' ..Т ~- ллвлс+плв+в Алв~слтллв б А'в'с+а б) л+внс Рис. 9.8. Физическое картяровапие ДНК методом неполного псревара рестрикгюои: а — порядок саитов рестрикции и фрагменты, образующиеся при неполном псреваре ДНК; 6 — авторалиограмма меченых (н) фрагментов после гельзлектрофореза Для построения физических карт ДНК крупных плазмид или вирусов прежде всего конструирукп банк генов, клонируя фрагменты, полученные частичным гидролизом ДНК мелкощепящими рестриктазами. Установление порядка фрагментов проводят метолом так называемой "прогулки по хромосоме", при которой с помощью гибридизации осуществляют последовательный поиск в банке зех клонов, которые перекрывают уже картированные клоны (Венчает ег а1., 1983).
Для этой цели очень удобны векторы, у которых па концах полилинкеров находятся фагоспецифические промоторы, например, ХГЭЛВН или ~,Е(Х (см. рис. 7.7), а также космиды рЖЕ15 и р%Е16 (%аЫ ег а1., Глатга 9. Анализ гвногг и гвномов 293 (987). РекДНК обрабатывают мелкощепящей рестриктазой, а рестрикты транскрибируют (и п(го полхолзпцей фаговой Р)(К- пол имеразой. Меченый транскрипт и служит зонлом лля поиска соседнего фрагмента, перекрывающегося с предыдущим (рис. 9.9). Так можно о прогуляться в на расстояния, не превышающие нескольких сотен тысяч пар нуклеотилон, поскольку шаги при "прогулке" опрелеляются размером вставки. Концы молекул метят каким-либо способом ло их обработки рестриктазами, а затем после разделения рещриктов гель-злектрофорезом выявляют концевые фрагменты с помощькт авторалиографии.
5 г Клоннронн опас з фрагьгенты а) .а рта 5 ртт Фрагмент 5 в векторе Ф ртт Рсстрюгг фрагмента 5 транскрнвгои ш тгцо Каннской транскрнпт б н) йгрюмснт б, найденный с помощью концевого транскрнпта Рис. 9.9. Схема физического картированин ДНК истовом "прогулки по хромосоме" (а) и последовательные этапы поиска следующего клона (гл в, г) Хромосомы.
Важная процедура программы полного гснстического анализа какого-либо сложного генома — построение физической карты кажйой хромосомы. Достаточно простым, но грубым, является метод гибридизации хролзосом )и зйи, если имеется возможность приготовить молекулярный зоил для картируемого гена. Его разрешение — !О' — (Ов п.н. Уточнение картирования осугцествляется по мере клонирования все более мелких фрагментов (рис. 9.
(О). Такие фрагменты используют и лля дальнейших Глава 9. Анализ генов и геномоа 299 жение). Перечисленные ранее изменения происходят в случайных мес|ах, но выявляться будут те рестрикты, шщ которых имеется зонд. При ню|нчии псщходяших праймеров возможен и другой подхол: анализируемая область ДН К мупьтиплицируется с помощью полимеразпой цепной реакции (см. приложение), и после гидролиза ее заланной рестриктазой образовавшиеся фрагменты ДНК анализируются гельэлектрофорезом, ДПК-зонд и праймеры, а также выявляемый ими ПДРФ в со|юкупносп| представляют собой систему маркирования определенно|о локуса,:ы наследованием которого можно следить.
б) х т Рис. 9.11. Схема, поясняющая причину возникновения полиморфизма длин рестрикционных фрагментов: а -- сайты деиствия рсстриктаз Х и У около аллелей М и ац б — злектрофореграммы результатов псрсвара ДНК диплоидпых клеток, име|ощих разный гепот'ип, рестриктазаьш Х и У; 1 — рссгрикт Х лля обеих аалслсй; 2 -- гстерозяготность по гену М, 3 — гомозиготность по калеви М; 4 -- гомозиготность по аллели го. Зоны выявлены с помощью меченого зо|ща х |сну Для картировапия генов важны случаи, когда изменения в сайтах ресзрикции происходят в самих генах или достаточно близко от них, что дает возможность различать их аллели. Допустим, аллели некоторого гена М, присутствующего в соматической клетке, "вырезаются" одинаково рестриктазой Х и по разному— рестриктазой т'.
Разницу в длинах рестриктов выявлякп. с помощью зондов к этому гену (рис. 9.1!). В данном примере видно, что геп М полиморфен по отношению к рестриктазе т'. Такой жс анализ, проведенный с ДПК родителей, позволяет определить происхождение тестируемой аллели у данной особи. 296 Часть И. >*'ея»»»»нже»ерин и> Ы>го Описанные ПДР>Р-к>аркерь> являются диморфными„так как маркирук>т только лва аллельных состояния -- наличие сайта рестрикции или его отсугствие.
![](https://s.studizba.com/z.php?f=/templates/si/i/noavatar.png&w=100&h=100&t=1"){kind=avatar}
