Рыбчин - Основы генетической инженерии - 2002 (947310), страница 52
Текст из файла (страница 52)
Генная ииасенерия!л иио и = !п(1 — р)/!п(1 — гп/М). Так устанавливается число клонов, содержащих рекДНК, которое необходимо о вобрать для обеспечения заданной вероятности. При гп/М((1, что характерно пракпгчески для всех геномов (кроме вирусных), и = — М/гп х!п(!-р). Ориентировочные данные по числу клонов в банке для некоторых организмов представлены в табл. 9.!.
Таблица 9.1 Количество клонов в геномных библиотеках различных организмов, обесиечиваюнгее 99%-ную вероятность встречас- мости определенного гена 'Средний размер вставок . — в тльн. Векторы для клонирования. Очевидно, что уменьшение значения га приводит к пропорциональному увеличению значения п. Поэтому для создания банка генов, казалос, следует клонировать как можно более крупные Фрагменты ДН К.
Однако чем длиьшее 4рагмегггы, тем труднее с ними маньщулировать и сложнее их анализировать. Достаточно рутинны процедуры с молекулами ДНК размером до 50 т.н.н. Работа с молекулами ДНК длиной сиьцие ! ОО т.п и. требует специальных методов и прибо- 1лззз 9. Анализ генов и гено>ннв 27! ров. Поэтому выбор вектора опрелеляется необходимым размером вставки, который в свои> очередь зависит от цели созлания банка. Наиболее распростри >синая задача молекулярных биоло>ов— поиск и анализ каких-либо конкретных генов. В большинстве случаев для этого лостаточно и меты еномные библиотеки, созданные с помощью фаговых векторов ).ЕМВ(.3, >,2001, Х.ОКГ8 и ХГ!Х, а также с помощью фазмил типа ),рМ'г'А!31 (см.
табл. 7.2) Размер вставки цри этом не превышает 22 т.п.н. В некоторых случаях (сложнзя регуляторная система, много интронов) используя>т космиды, имеющие повышенную емкость (45 т.п.н.), в часпюсти, космиды с2КВ (см. рис, 7.! 0) и НогЫ (О>бзоп ег а!., 1987). Космилы типа (.ог(зг обладают оп-сайтт>м фага й, что обеспечивает независимость числа их копий от величины вставки и поэтому прелотврап>ает сегрегац>по клонов по размеру в процессе их амплификации, Олнако прихолится учитывать трудности, описанные в гл. 7, в частности: 1) космилы более чувствительны к качеству Д1-! К, взятой лля к,л>пирования; 2) упаковка в головки ьл >4!го рекомбинантных космид менее эффективна, чем фаговой ДНК, 3) процесс селекции трзнсформантов, солержащих рекомбинантные космиды, более затруднен, чем прямой отбор рекомбинзнтных фагов; 4) банк в виде бактериальных клонов труднее хранить, чем фаговый; 5) скрицинг легче проводить с фзговыми клонами, чем с бактеризльными.
Поэтому космиды применякп только в случаях, когда указанный размер вставки действительно > >еобхолим. Отдельная задача — полный анализ генома, его физическое картирование и секвенирование. Здесь нрихолится начинать с клонирования как можно более крупных фрагментов с тем, чтобы облегчить процесс составлении карты. Для этого используют лрожжевые векторы >гЛС (см. гл. ! 1).
Они незаменимы также при анализе гигантских генов, таких как ген листрофина, размер которого 1800 т.п.н. Перспективны векторы ВЛС, основанные на использовании оН-сийга плазмилы Р и позволя>он>ие клонировать фрагменты ДН К алиной ло 300 т.п.н. (%|зцуа ег а!., !992). Промежуточное положение занимают векторы, основанные на репликоне и системе упаковки фага Р1.
272 Часть 11. Генная инженерия ьн Мзго Напомним, что в систему клонирования входят рециписнтныс клетки, причем лля разных типов векторов рекомендуется свой штамм. Например, болыпие палиндромы клонируются в 7 векторах„ только если в клетках есть мутации гееВ, гесС и збсВ.
Выделение и фрагментация ДЕЖ. При любом способе вылеления геномной ДНК ее концы имеют случайную структуру. Конечно„после фрагментации ее рестриктазами концевые фрагменты неспособны встраиваться в вектор, поскольку связываются с ним лишь одним краем. Чтобы свести к минимуму их конкуренци1о за вектор, средняя длина фрагментов вылеленной ДНК должна превосходить длину вставки, как минимум, в четгяре раза. ДНК млекопитающих обычно выделяют обработкой клеток протеиназой К в присутствии ЭДТА и ЯЭЯ с последующей экстракцией фенолом.
Этот метод позволяет получать ДНК со срелним размером 100 — 150 т.пль, т. е. он приемлем лля конструирования банка генов только с использованием ) векторов. Молекулы ДНК длиной более 200 т.п.н. получают формамилным методом (Кпр(ес ег а1., 1987), что лостаточно для клонирования с помощью космид. Разработаны методы вылсления- ДНК со средним размером несколько миллионов пар нуклеотилов. В этих случаях лизис клеток и вылелсние ДНК ведут в агарозном геле.
Также в геле проволят и ее последующую обработку рестриктазами до получения фрагментов размером 200- 500 т.п. и, необходимых для клонирования в УАС'ах. Для получения геномных библиотек млекопитающих требуется около 200 мкг ДНК. Первый банк генов был создан для клеток Е.
соИ (С!аде, Саг(юп, 1976). Вактериальную ДНК авторы фрагментировали гилролинамическим способом, а встраивание фрагментов осуществляли через АТ-коннектор. Этот метод фрагментации ДНК обеспечивает статистически равномерное распределение точек разрывов по молекулам ДНК и позволяет регулировать срелний размер фрагментов. Необходимость случайного дробления ДНК понятна.
При этом, во-первых, нет опасности, что какой-нибудь ген пе будет представлен в банке из-за его систематического расщепления (например, рестриктазой при полном гилролизе). Вовторых, обеспечивается перекрывание клонируемых фрагмен- Глава 9. Анолиз генов и геномоа 273 тов, что важно лля проведения "прогулки" по хромосоме, т. е. лля перехода от олного фрагмента к соседнему с ним (см. с. 292).
Олнако эффективность «ло«провалил фрагментов ДНК, полученных механическим дроблением, оказалась нелостаточной лля конструирования прелставительных библиотек из-за пеобхолимости проведения дополнительных ферментативных обработок лля их лигирования. Для преололенил указанного нелостжгка было прелложено лля фрагментации выделешюй ДИК проволить ее частичный перевар двумя мелкошепящими рестриктазами (Машайв ег а1,, 1978).
Авторы использовали рестриктазы НаеП! и А(и1, узнающие тетрануклеотилы и образующие при разрезе ровные концы. Клонирование проводилось с применением линкеров, а вектором служил Харон ХСЬ4А. При часги шом 1тьчролизе 11НК одной ресгрикгазой получается менее предсгавительный банк, но существенно упрощается пропелура его получения. С указанной целью широко используется рестриктаза ЮонЗА, образующая совместимые липкие концы с Вал~Н1-концами. Клолировалие. Из данных табл. 9.1 видно, что лля составления представительной геномной библиотеки необходимо собрать большое число клонов, лостигаюшее для высших эукариот нескольких сотен тысяч и даже миллионов. Подчеркнем, по речь идет о клопах„солержащих рекДНК. Отсюла понятно, почему в системах клонирования, прелназначенных лля конструирования таких библиотек, серьезное внимание уделяется проблеме прямой селекции подобных клонов.
Ни один из методов не абсолютен. По этой причине старакп ся поставить, как мини мулл лва барьера против клонов, не солержащих рекДНК Одним из таких барьеров служит ограничение размера ДНК при ее упаковке в фаговые головки. Поэтому часго применяют векторы, сконструированные на базе ДНК Фагов ). и Р1. Вектор замещения ХБМВ1.3, емкость которого составляет 7- 20 т.п и., приспособлен для клонирования 5аиЗА-рестриктов геномной ДНК. БуФерный фрагмент вектора ограничен полилинкерами, содержащими сайты ВаглН1, ЕсоК1 и Яа(1 во взаимообратном порядке (см. рис, 7.7).
Этот фрагмент "вырезают" с помощью рестриктазы Вагл1П (рис. 9. 1). Чтобы прелотвратить возможность езО !ювтОрнОГО встгзаивання В ВектОрные мОлекулы, От него с ЛО- мощью рестриктазы Есой! Отн!епгиют низкомолекузнгрные ЮангН1- Есой1-концевые учаспсн, которые затем удаляют из реакз!нонной смеси изопропанолом. РеномнаяДНК полвергастся частичному гилролизу рестриктазой ЛаагЗА, а 5'-концы образовавшихся рестриктов дефосфорилнрузотся. в в Гсномная ДНК Я ~ ВЕ- 1:Я ~ бк 20 тон. ' !4 вин 9 тиль ~ Ваобц, Бсак! в в В Е Е Е Е В ,го! ваш 1 унаковка ш ваго Расссв на Р2-анзогснм Отбор Яр! -фатов Ганомнгог библиотека Рис.
9.!. Схема создания гсномной библиотеки с помощью вектора вЕМВ1З. Сайть! рестрикции: Б — ВашН1, Š— Есай1, Я вЂ” ЬаЛ, За — ЛаиЗА После процедуры лигирования проводится упаковка ДНК ан гугго в фаговые головки, причем из-за ограничений по размеру упаковывается только рекДНК. Дополнительный селективный фактор — отсутствие н рекомбинантпых фагах генов гег! и яигн, что позволяет их отбирать по зрг фенотипу, Высевал на Р2-лизогены 274 Часть !1. Генная игслгенерил нг ту!го ЯаоЗА Щняочная фосфашза Яа Глава 9. Анализ генов и гснолоо 275 (см. гл.
4). Отметим, по сайты ВигпН ! в рекДНК не восстанавли- ваются, поэтому лля вырезания встроенных фрагментов применя- ют рестриктазу Ьий. !окР . . "Г Ф ''гккопР Вгф Р РАсиасосВП, ! Кзо всс! х в ~. Ф, Тс '"' '-' и. --Ф !окР' - -', - В РП Рис. 9.2. Вектор рлс11бзасВП, лредназначснный ллл прямой селекции клопов, содержащих рскДНК. Направление !окР-саГтпа указано черной стрелкой. Промозоры: Ес — Е.
![](https://s.studizba.com/z.php?f=/templates/si/i/noavatar.png&w=100&h=100&t=1"){kind=avatar}
