Рыбчин - Основы генетической инженерии - 2002 (947310), страница 49
Текст из файла (страница 49)
имеющие Рхт)-сайт (СТОСА)О). Добавление к ним олиго1дб), а к клонируемому фрагмснту— олиго(с1С) позволяет после образования рекДНК восстановить Рхг1-сайт и вырезать клг>нируемый фрагмент с помощьк> одноименной рсстриктазы: Вектор Ртг) ФрагментДНК ...ХХХХХС%'СА-3' 5'-ХХХХХХХ...
...ХХХХХС-5' 3'-ХХХХХХХ.. 1 Терминальная трансфераза ...ХХХХХСХОСАОООООО-3' 5'-ХХХПХХХХ... ...ХХХХХХ-5' 3'-СССССССССХХХХХХХ... ~ "Отжиг"' ...ХМ ПХХСТОСАЬО ОООО-3' 5'-ХХХХХХХ... ...ХХХХХ ПХО-5' 3'-СССССССССХХХХХХХ.., 1Репарация щ и>о ..ХХХХХСТОСАООООООООООХХХХХХХ... ...ХХХХХОАСОТСССССССССССХХХХХХХ... Вектор Ркй ОС-коннектор Фрагмент ДНК Если фрагменты объединены с помощью АТ-коннектора, разъединить их можно пуклеазой 51 в условиях частичной денатурации ДНК (45 — 50 % формамида). 254 Часть 11.
Генная инженерия Л> лего Однако образуннпиеся при использовании копнекторного метода гомополимерные участки снижают эффективность экспрессии клонирусмых генов, если транскрипция осуществляется с векторного промотора. Кроме того, опи обусловливают внутримолскулярные рекомби> щции т гпп по гомологичным у >веткам и тем самым увеличивают нестабильность рскДНК.
Синтез олигонуклеотидов и генов Олигонуклеотиды (липкеры, адаптеры, праймеры, промоторы и т. п.) синтезируют химическим методом, а гспы и их фрагменты — химико-ферментативным. При синтезе однщ>итевых олигонуклеотидов наращивают их пеночки, присоединяя определенные звенья в зада>пюй последов>ательностэ>. Побочные реакции предотвращают химической защитой реакциошюспособных групп, которые не учасгвуют в реакции полнмеризации.
Таким ступенчатым способом синтезируют лишь 3 — 4-членные щ>игонуклеотиды. При большем количесп>с членов разделение продук>т>в реакции загрудняется, и тогда применяют блочный метод синтеза, при котором объединяют предварительно синтсзировгпщые ди- или трипуклеопщы. Так синтезируют 1Π— ! 5- членныс оли>онуклсотилы. Из пих после удаления защитных групп можно собир;пь фрагменты генов или даже целые гены. Аналогично происходит синтез олигонуклеотидов в твердой фазе, только в данном случае их первые члены соединяют с нерастворимой ма>риной (специально модифицированный полимер). При этом растущий олигонуклсотид также оказывается в твердой фазе, что значителы ю облегчает сп> очистку от побочных продуктов реакции и смену реагентов.
По завершении синтеза готовыи одигонуклеотид отдслякп от матрицы. Такой метод позволяет стандартизировать этапы синтеза олигонуклеотидов. На его основе сконструированы так называемые си>пезаторы ДНК, осущсствля>ощис полный ащоматичсский синтез олигонуклеотидов длиной в несколько леся.гков членов со скоростью 4 — 5 нуклсотнла в час. Основные принципы хпмико-ферментативного синтеза двунитевых фрагментов ДНК разработаны Кораной в конце бО-х годов.
Они предусматривают несколько этапов данного процесса. Глава О. Опернянн ни До<< 255 На первом этапе химически синтезируют 10 — 20-членныс однонитевыс олигонуклсотилы, из которых затем образуют двуь <итевыс фраь менты ДИК. При этом с<>сеяние олигонуклеотиды, относящиеся к комплементарны м нитям, лолжны частично перекрываться друг с другол< 5 — б нуклсотилными остатками. Далее 5'ОН-концы олигонуклсотидов фосфорилнруют с помопп ю полинуклеотидкиназы и поочерсдьн> обьслиняют молекулы с перекрывающимися комплементарными последовательностями, а смсжныс олигонуклсотиды нсшившот" ДНК-лигазой: 'ОЕ1 3'ОЕЕ 5'ОН ИОН ИОН >НУ <ОН 5'ОН 5ОН 5'О!1 1'ОН 5О1 Пол инуклеотидки паза ДНК-лигаза 3'ОН 5'р Таким способом был синтезирован первый полный гсн— гсп тирозиновой тРНК дрожжей (К)н>тапа ег г>!., 197б), представляющий собой двунитсвой фраь мент ДНК, состоя>ций из 199 п.н.
К 5'-концам нитей бьши лобавлены однонитевые участки ЛАП, с пол<оьь<ььо которых ьен встроили через ЕсоКЕ-сайт в вектор (рис. 8.4). Для синтеза пром<порпого н тсрминирующего участков гена и части геьш, колируьошей процессирусмый участок транскрипта, были использованы информапия о нуклеотидной последовательности молекулы тРНК и ес предшественника, а также данные с> строении бактсриальных пр<>моторов и терминаторов транскрипции. Из синтезированных 38 однонитсвых с>лиьопуклсотидов сначала было собрано есмь лвунитевых блоков с од к>нитевыми концами.
Эти блоки солсржали от трех до семи олигонуклеотидов с комплементарными участками. Далее они были сн>следовательно объединены в единый гсп. Оп имел мутаци к>, позволя вшу ю тРН К супресеиро вать ам бор-мутации. Именно такой эффект и был обнаружен при введеь<ни синтетического гена в клетки Е. со(<', что свилстельствовало о его функциональной активности. 25б Часть Н. Генная 1!нжеяерич В> Ыгго Иа Ф 151 . "'~ >5 АОООООТООТЫТЛО'|>С5ЛААОТТТТСАООСТТТСТТЛА ;"О,> !1,! Гл ''сСТТ~~ГСССЛССЛССЛТСЛСТ ! ТСАЛАЛОТССОЛЛЛО "Т .А т Ос т ТООААОсттсАйстлстОссОтстлААтстслО л С гм 0 ААССТТСОАЛОТСОАТОАСООСАОАТТТАОАОтт>ГО в СОвОТАА ТООзОСЛССЛССССА ЛОООСТСОССОГ>ттт С '' ,.'"'т',1,!!11!.'1!1;!1,1~.'11~1,'...О ,Ит 'ААОссАттлсссагсОТОООстггсссОАОСООССААА О, ' ~ 5 Л АцлссгАЯФОАОООААтАЛОсссттсжсссОСОТАО т, ' А .
т ООССТООГСССТТЛ!ТСОООЛЛОСООООСОСлтелт - т ОАААОАОтТОСАТТОТОААлТОТСОССССОСЛОТЛ Л ~т ;! 1~111!! 11! !'1! !!1!!11!! !! 1!1!1! ААттстттс тсАлсОтллслстттлсАОсООООСОтсл т -5б Рис. 8.4. Строение гена гирозиновой тРНК дрожжей, синтезированного в лаборатории Кораны. ж — КОНПЫ ХИМИЧЕСКИ СИН!СЗИРОВаННЫХ фРаГЛ>ситОВ; ° — КОННЫ блоков. Цифрами обозначены номера нуклсотилов, начиная от старта трапскрпппии гена Сложность и трудоемкость описанного процесса очевидны.
Он был заметно упрощен использованием ДНК-полимеразы для достройки частичных дуплексов с выступающими 5'-концами до полностью двуцепочечных фрагментов: 5'-ХХХХХХХХХХХХХХ-3' 3 ХХХХХХХХХХХХХХ1Х 5 > 5'-ХХХХХХХХХХХХХХХ-3' 3'-ХМ~ФИ~ХХХХХХХ !ХХ-5' Такие дуплексы затем последовательно обьединяют с помощью ДНК-лигазы фага Т4 и внедряк>т в вектор. На практике по мере увеличения числа лигазных "сшивок" становится ьес труднее очи ньать продукты реакции и получать их Глава 8. Олерсявгг ла ДггК 257 в достаточном количестве лля дальнейшей работы, увеличивается и расход исходных синтетических олигонуклеотидов.
Поэтому в дальнейшем нри создании синтетических генов стадии накопления и очистки промежуточных фрагментов стали осуществлять также методом клонирования, снабжая фрагменты для этого концевыми вспомогательными сайтами рестрикции. Сам же ген "собирают" в векторе, имеющем подходящий полилинкср (рис. 3.5). Вспомогательные сайты рестрикции, оказавшиеся внутри гена, убирают последовательным де яствием соответствующей рестриктазы, нуклеазы В! и ДНК-ли!азы. Ю кт кз кз К4 Ф! ФШ йааа аГ г: Кг кз, кк Фн Ф Дгаг-лигаза К4 к1 кз КЗ,К4,ФП1 кз ---Э ДНК-аагаза ККЮ.ФГ (г Ъ Лнх-аагаза \ Рис.
8.5. Схема сборки синтетического гена из фрагментов Ф1, ФП и ФВ К а -- фрагменты (Ф) гена, концы которых приспособлены лля взаимодействия с липкими концами различных рестрикгаз К; 6 — последовательные стадии внедрения фрагментов в кольцевой вектор и удаления вспомогательных сайтов рестрикции К2 и КЗ Направлегвп.й мутагеиез Спектр мутаций широк, и все их виды (точечные, делеции, инсерции, инверсии) можно осуществлять направленно методами )л ипо, получая заданное изменение в определенном гене и даже нуклеотиде.
Важность этого подхода трудно переоценить. Кроме получения измененных белков существенно облегчилось само 258 Часть 1!. Генная нняеенерня !и 1ГЕео конструирование рекДН К. Появилась возможность вводить ил~ убирать в нужных местах сайты рестрикции, добавлять регула торные сигналы в начало или в конец генов, элиминировать ин троны и т. п. Рассмеприм сначала получение точс шых мутаций. Различаю лва их типа -- сайт-специфический и сегмент-специфический Первый сводится к введению определенной мутации в задгцшьп сайтДНК. При осуществлении мутагснсза второго типа мутаци~ вводя~ в учасгок ДН К ограниченной длины, а распределяются ощ случайным образом. Савел-еащи4ический леугпагенез.
Его можно проводить тольк~ в случае, если известно строение соответствующего участка ДНК Для этОГО синтсзиру!От Олигонук лсотид с заданным измснс1!исм ~ затем интегрируют его в геном. Зтот метод бгял разработан пр~ постановке опытов по мутагенезу ДНК фага (1Х!7 (Нц!СЫвоп ет а1., !978). Лвторы синтезировали 7 — 10-членныс оли гонуклсотиды, кохшлементарные выбранным участкам рХ!74 При этом были запрограммированы определенные точечные мутации — транзиции, трансверзии, лслеции и вставки основа ний. Олигонуклсотиды гибрпдизовалн с однонитсвой фагово) ДН К при ! 0 "С и использовали в качестве праймеров для синтс. за 1и Гнев второй цепочки ДН К (рис. 8.б). Синтез вели с помощью клсновского фрагмента ДНК-полимеразы 1, чтобы исклю чить ньнцепление праймера при завершении синтеза.
![](https://s.studizba.com/z.php?f=/templates/si/i/noavatar.png&w=100&h=100&t=1"){kind=avatar}
