Рыбчин - Основы генетической инженерии - 2002 (947310), страница 51
Текст из файла (страница 51)
При нсобходимосги ник можно переместить с помощью ДНК-полимеразы 1 (ник-трансляция) в нужное место. Другой способ прсдусмагривает делегирование в рскомбинантной плазмипс сегмента, который предстоит мутировгпь. Далее исходную и делегированную плазмилы линеаризуют через разные единственные сайты рестрикции, децатурируют и проводят совместную ренатурацию.
В результате наряду с исходными плазмидами образуются гстсродуплексные молекулы с однонитевой петлей в области мутируемого сегмента. После обработки смеси бисульфитом натрия и послсдуюгцей трансформации клеток приступают к поиску мутантов Образование делеяий. Ранее уже отмечалось, что делении и вставки размером в несколько десятков нуклеотилных пар можно получить методами с использованием олигонуклеотидов. Делеции и вставки размером в несколько нуклеотидных пар можно получить, удаляя высгупающие концы рестриктов нуклеазой В1 или заполняя их ДНК-гюлимеразой.
В результате после воссоединения рестриктов ДНК-лигазой фага Т4 в молекулах ДНК появляются микроделеции или микровставки. При желании увеличить размеры лелеций концы рсстрикгов дополнительно обрабатывают подходящими экзонуклеазами. К большим делециям приводит удаление из фрагмента ДНК участка, находящегося межлу двумя сай шми рестрикции„послеловатсльным действием рестриктазы и лигазы. В ряде случаев для секве пирования или анализа больших учасгков эукариотических генов необходимо иметь набор делеций, которые начинаются в общей точке и простираются в анализируемую область на разную длину.
Это позвшиет не проводить физическое картирование и секвсцировать се с использованием общего Глава 3. 0лерияии иа ДгГГГ 265 праймера. Предложены различные методы образования таких дслеций. Из методов !и и(гго наиболее удобен способ с использованием экзонуклеазы Ш (Нсп)кой'„1984). Он основан на устойчивости выступающих 3'-концов к действию этого фермента (см. гл. 6). Для его использования необходимо, чтобы в векторе рядом с анализируемой областью находились единичные сайты рестрикции А (ровные или 5'-выступа1ощис концы) и В (3'-выступающие концы). После действия соответствующих рестриктаз линеаризованная ДНК подвергается обработке экзонуклеазой Ш в течение разных интервалов времени (рис. 8.11).
Затем нуклеаза 81 и ДНК-полимераза формируют ровные концы у образовавшихся делеционных вариантов, которые, наконец, закольцовываются с помощью ДНК-лигазы фага Т4, образуя искомый набор рскДНК. В А В А 5ае — 3' Ф' — ...... Игцщ~~: з 5' В.е —:::.ггцгбшлш Вч.— вч.. нл Калачевые реедНК а елбарсы лелещФ Рис 3. ! !.
Схема образования набора делений с помощью зкзонуклеазы Ш. А и  — сайты рестрикции Анализируемая область заштрихована; стрелкой указано положение праймера Д!и образования делеций в клонируемой ДНК методом ие таво сконструированы векторы, которые содержат в своем составе 266 Часть Ра Гевдая аюкедселид лч хдед элементы гранспозонов, обладаквпих случайными сайтами транс- позиции. Так„в векторе рВЕПА-1 (фирма С(бсо ВИ ), создан)а)м на базе плазмиды р()С19, встроены концевые инвертированные повторы б транспозоня Тп!000 (рис.
8.12,и). Векчор содержит маркеры лля сслскпии ( Ус" и Ктх) и конт рсслекции (зггА — чувствительность к отсу1ствинэ стрептомицина, зас — чувствитсль) юсть к присутствия) сахярозы), а также локус!асХ' с полилинкером. Клоны с рскомбинантными плазмидами выявляют по сс-комплемсптации. Далее эти плазмиды переносят в клетки, содержащие плазмиду рХК(24043 с ~сном трянсгюзазы Тп1000)ьрА, которая активирует б-повторы и вызьиаст образование делсций.
Комбинирование маркеров позволяет отбирать делении, простирающиеся в клонируемый фрагмент от определенного б-повтора. 1)а средах с тетрацикпшом и сахарозой происходит отбор дслсций в на))равлении по часовой стрелке, а в присутствии стрептомициня и канамициня — в противоположном направлении. Рядом с б-повторами находятся промоторы фатов ТТ и ЬР6, которые позволяют с помощью универсальных првймеров секвснировать клонируемую ДНК с двух концов, используя набор отобранных делеционных дария)пов. Присутствующий в векторе сад-сайт фага Л может бьггь использован для линсаризации рекДНК или лля сс упаковки в фаговые головки. а) б) Т7 л Рис.
8.12. Строение векторов р))ЕПА-1 (и) и р)ЭЕЕ-ВАС (6), предназначенных ддя образования дедеций в кдсвируемой ДНК Вектор рВВПА-(эффективен при внесении делений во фрагменты ДНК размером до 40 — 50 т.п.н., поскольку из-за его муль- Глава 8. Операции ни „«П!К 267 тикопийности более крупныс вставки нестабилы«ы. Этого недостатка лиц«ен вектор рГЗЕЬ-ВАС (рис. 8.! 2,6), сконструированный заменой Со)Е!-подобного рег«ликатт«ра в плазмилс р13ЕЬТА-1 на Е-рспликатор плазмиды рВАС1081. (см. рис.
7.13). Вектор р0ЕЬ— ВАС позволяет стабильно клонировать фрагменты ДНК ллиной ло 200 т,п.н. и внос«пь в них делении (Чистяков, Чумаков, 1996). Для работы с ним используют штамм Е. соб 1)Н10В (см. табл. 7.1) и плазмиду рХ)1134043. ВОПРОСЫ ДЛЯ ПОВТОРЕНИЯ И ОБСУЖДЕНИЯ 8.1. Рестриктазы йа«пН! и Вл(П не являются изошизомерами, «ю образую~ одинаковые липкие концы. Возможно ли ковале«нное объединение разноименных рестрнктов в присутствии ДНК-лигазы? 8.2. Межлу какими нуклеотилами в эксперименте, представленном на рис. 8.6 следует запланировать разрывы лля образова««ия фрагментов Ф1, ФП и ФШ, если В2 = ЕсоЫ, а КЗ=П«««гЛП? Почему обработка цуклеазой 81 рекомбинантной ДНК, линеаризовапной через сайты В2 и ВЗ, не нарушае~ целое~ности «сна после лигирования? 8.3.
Каким образом осуществляют ориентированное встраивание фрагме«па ДНК в вектор? 8.4. Какие операции позволяют проводить линкеры, предназначенные лля белковой инженерии? 8.5. Почему многие алаптсры готовят в вариантах с лсфосфорилированными 5'-концами'« 8.6. Для создания ЕсоИ-сайта в «енс (ас27 а 5-м колоне гуаннн был заменен аленином: 4 5 6 ЕсоК! АСО ОА3: ГСУь — '~АССсМч'1'СА. Как бы это слопали вы? 8.7. Составьте план г«кспериь«с««та по получению набора делений а««ализирусмого фрагмента ДНК с помани,ю вектора рГЗЕЬТА-1. 8.8. Вам поставлена задача получить набор фаговых мутантов, у которых поврежлсн только один определенный ген.
Составьте план экспериме«па по выполнению это~о залания. 8.9. Как решается проблема циркуляризации фрагме«пов ДНК в процессе их лигирования? 8.10. Каким образом можно аволить пики в заданные участки ДНК? Глана 9 АНЛЛИЗ ГЕНОВ И П)В)ОМОВ Информационным центром всего живого, оиределяквдим индивидуальность каждого организма и вида, к которому он принадлежит, является геном. По опрелелению он предсганляет собой совокупность всех ~евон организма с их регуляторными сайтами и включает также "молчащие*' участки ДНК с неизвестными пока функциями. В простейшем случае ген содержит информацию о структуре одного полипептида.
В более сложных случаях он может кодировать несколько полипептидов, считываемых в одной или разных рамках, с частичным или полным перекрыванием генетической информации об этих иолипептилах. В некоторых ситуациях можно говорить о гене, находящемся внутри лруг ого гена. Белок-кодирующие части гена могут быть разъединены интронами или лаже находиться на разных хромосомах.
Определенная функция организма зависит от одного или нескольких генов. Отсюда понятен интерес к анализу структуры и функций генов и геиомон. Практически неизбежный первый шаг в проведении этого анализа — создание геномной библиглеки (банка генов). Оиа прелгллнляет собой совокупность всех нуклеотидиьгх иослеловательносгсй хромосомной ДНК организма н виде фрагментон ДНК, клоииронаниых в векторах. Если фрагменты физически картированы, т. е. если установлено их расположение на хромосомах, то такукз библиотеку называют геномной энциклопедией. Банки служат источником материала для изучения строения и регуляции инливилуальиых генон, а также лля исслеловаиия структуры и функции белков.
С их иомощьк> также можно решать проблему сохранения генофонда исчезаклцих видов. Для создания банка генов осуществляют тотальное клонирование, используя для встраивания в вектор смесь фрагментов ДИК, Глава 9. Лиивиз генов и геиомов 2б9 полученнук> дроблением всей клеточной ДНК. Далее тем или иным способом отыскивают в банке клон с нужным геном. Индивидуальные гены составляютлишь незначительную часть банка, и отыскивать их довольно трудно.
Для этого применяют метод гибридизации колоний и гораздо реже — иммунологические методы. Серьезный прогресс в анализе геномов достигнут благодаря разработке новых методов и подходов. Это и ввеление физических геномных маркеров (ПДРФ, см. с. 294), появление быстрых способов картирования клонированных генов, возможность выяснения физической структуры геномов методом Г(ОЕ (гель-электрофорез с инверсией электрического поля, см. приложение). Например, генетически линейная хромосомная карта Сии(иЬисгег сгевсеигив физически оказалась кольцевой. Ряд метолов детально описан в пособии "Анализ генома. Методы", ! 990. Точнейшей из операций гю анализу строения генов и способов их регулирования является секвенирование.
Секвенированис клонированных ~енса зачастую проводят гакже в тех случаях, когда оптимизируют их экспрессию. Секвениравание геномов помогает не только изучать их структуру, но и понять пути их эволюции. В практическом плане секвенирование важно для приготовления зондов с целью диап юстики генетических заболеваний, идентификации микроорганизмов и т. д.
Проблемы создания геномной библиотеки Число клигиов в банке. Основная проблема, возникающая при создании банка генов — необходимость обеспечения его полноты. Она определяется вероятносзъю встречаемосги (р) искомого гена в коллекции„состошцей из и клонов: р = 1 -- (1 -- гп/М)", где М вЂ” молекулярная масса генома; гп — сред1цгя молекулярная масса клонируемых фрагментов ДНК. К банкам генов условно относят такую коллекцию клонов, в которой индивидуальные гены предсгавлены с вероятностью не менее 0,95. Обычно на практике задают конкретную вероятность (0,90; 0,95 или 0,99) и, зная М и т, опрелеляют и (С1агке, Сагбоп, 1976): 270 Часть 11.
![](https://s.studizba.com/z.php?f=/templates/si/i/noavatar.png&w=100&h=100&t=1"){kind=avatar}
