Рыбчин - Основы генетической инженерии - 2002 (947310), страница 46
Текст из файла (страница 46)
(см. обзор %оЫ)сЬеп, Мц!Ь, 1993). В частности, векгор рИ486 (около !00 копий на клетку; рис. 7.18,а) прелназначен лля клонирования и экспрессии > снов стрептомицетов, имеющих собственный пролютор (<>>ап1 ег а!., 1986). С целью прямой селекции искомых трансформантов гены внелряют без собственного терминатора >ранскрипции в полилинкер, 1 лава 7.
Века>оры д»я клонирования к й>кн>ерина 237 расположенный перед геном иео (устойчивость к канамицину), у которого нет промотт>ра. Внелрение осуществляют в одинаковом направлении с геном лев. Селекцию ведут по признаку устойчивости трансформантов к канам ипину, так как благодаря последовательности Шайна — Далгарно, находящейся в конце г>олилинкера, в клетках, содержащих рекДНК, ген пер экспрессируется.
В клонирующих векторах (например, р!3702, рис. 7.18, б) для поиска рекомбинантных плазмил обычно использу>от ген тирозиназы те1, инактивация которого приводит к изменению окраски колоний грансформантов. а) б) мга ныш ', хы в щ вкд Есоя1 l И>Я Рис. 7.18. Векторы стра>ггомицет рП486 (а) и р11702 (6). Реиликатор (гер, оп) взя> из >в>азмидь> рИ! 01 Плазмидные векторы Ягергои>усек делают, как правило, челночными, >тт>бь> все предварительные операции по клонированию осуществлять в клетках Е со(1.
Второй репликатор берут обы >но из плазмиды рАС'т'С184, так как он более стабилен в клетках стрецтомицетов, чем репликатор рВК322. Стрептомицеты обладают мощными системами рестрикции и разру>лают ДНК, вводимую из Е. со(1 или из других стрептомицетов. Поэтому в качестве реципиента чужДНК наиболее приемлем безрестриктазный цпамм Х Ь Ыа>кт бб. Фаговые векторы стрептомицеж>в конструируют главным образом на базе ДНК умерешюго фага рС31 (41,4 т.п.н.).
Значительная часть его генома (до 1О т.п.н.) может быть удалена и использована для целей клонирования без нарушения его способности к вегетативному развитию. В фаговые головки упаковывается ДН К размером ~л Зб ло 43 т.п.ц., поэтому максимальная емкость 238 т!ас>ь 11. Геннон инаеенернн гн Итео фаговых векторов (с учетом присутствия в них селективных маркеров и полилинкера) равна 9-10 т.п.н. Кроме электротрансформапии для введения ДНК в клетки стрел>омицстов используют трансформацию их протопластов в присутствии полиэтиленгликоля. Э44жк>ивность этого пропесса— около 1О> траььсьрорман>т>в на 1 мю суперскрученной плазмидцой или линейной фаговой ДНК.
В опытах по клонированию эта величина издаст на два — четыре порядка. ЕРЛВНИТЕЛЬНЛЯ ХЛРЛКТЕРИЕТИКА ВЕКТОРГ>В Для клонирования генов в клетках Е. сой применяют векторы, скопе>руированные на базе ДНК плазмил и фап>в, а также вскторы, сочетающие в себе их свойства (фазмиды, фагмиды и космилы). В силу различных биологических и физических характеристик различпыс векторы используют лля разных целей (табл. 7.2). Плазмил>ьыс векторы наиболее универсальны. В мультикопийных плазмидах клопируют, как правило, фрагменты ДНК небольших размеров (до 10 т.п.н.), в малокопийных — срелних (до 30 — 40 т.п.н.) и больших (50 — !00 т.п.п.
и выше) размеров. Ограничение ьи>длине клонирусмых фрагментов ДНК вызвано главным образом низкой эффективное>ью трансформации клеток образующимися рекДНК. Для введения больших фрагментов ДНК в бактериальныс клетки используют метод их предварительной упаковки в фаговьье головки (например, РЛС-клонирова>ьие) или метод электротрансформацип (ВЛС-клонирование), а для переноса в клетки жив<нных предложены лругис способы (см. гл. 13). Векторы, основанные на использовании ДНК фага Л или его еоо-сайта, имеют емкость до 22 (фаговые векторы и фазмиды) и даже 45 т.п.н. (космиды). Они практичны в работе, и поэтому их используют д тя создания гсномных библиотек (см.
гл. 9). Клонирование и анализ небольших фраь ментов Д! !К в них менее эффективны. Векторы, использующие рспликаторы нитсв>рлных фап>в, применяют для >ьолучеьььля однонитевых фрагментов ДНК с целью их секвснирования или приготовления гибридизационных зондов. Глава 7. Веюлоры длл клонирования в 6аквералх 239 ВОПРОСЫ ДЛВ ПОВГОРКНИЯ Н ОВСУ ЖДКНИЯ 7.! Почему встроенный фрагмент чужДНК в вектор ЕМВ? 3 нельзя "вырезать" с помощью рестриктаз ВаглН! или Яаи3А? 7.2.
В векторах рВВ313 и рВВ322 имеется ген Тех, но в гибридных векторах он нс экспрессируется. Почему? 7.3. Прн получении рекДНК, основанной на ДНК фага Л, сначала объедннякпся плечи вектора через сох-сайты и только затем к ним присоединяется чужДНК. Почему' > 7.4. В каких случаях можно использовать бакгериальны й штамм лу? для прямои селекции рекДНК при работе с Л-векторами? 7.5. Можно ли при работе с вектором ЛСЬ4А использовать клетки гесА и проводить отбор рекомбинантов по Ярр -фенотипу? 7.б. Объясните, почему рекДНК, конструируемая при РАС-клонировании, содержит разные плечи вектора и нет комбиианнй с двумя малыми или двумя большими плечами? 7.7.
Какие факторы являются определяющими при выборе клонирующего вектора? 7.8. В каких областях исследования полезны липейпые плазмидные векторы? 7.9 В каких векторах и для чего используя>тся элементы ДНК нитевидных фатов? 7.10. В чем заключаются особенности клонирования больших фрагментов ДНК и какие векторы лля этого применяют? Глава 8 ОПН АЦИИ НАДНК Возможны многочисленные операции на ДНК ас нссга в зависимостии от цели их дальнейшего исполь юнания. В с енетической инженерии основная процедура — клонирование ДНК, проводимое для создания банка с снов всспс генома (геномной библиотеки), для получения банка генов отдельной хромосомы или ее части (частичной геномной библиспеки; такие банки называкп также клонотеками) и, кроме того, для конструирования рекДИК, содержащей определенный ген.
В белковой инженерии для полу сепия модифипированных форм белкон или пептидов сначала синтезируют копирующие их фрагменты ДНК. С развитием методов генной инженерии реальным стал направленный мугагенез, вытесняющий при изучении тонкой структуры гена классические мстолы мутирования. С помощью этой техники возмснкна плассовасс замена в белке одной аминокислоты на друсусо, что сблес част изучение механизмов катализа, субстратной специфичности ферментов, стабильности пслипептидов и т.
д. К операциям на ДНК относят также ее нылеленис из клеток, фрагментацию, фракционирование и очистку осдсльньсх фрагментов, формирование у заданного фрагмента ДНК концов нужной структуры и его обьсдинение с вектором, физическое картированис ДН К и тэь Больсссинспю этих операций контролируется или выполняется с использованием метолом элексрос)юреза в селе (см. приложение). Здесь нет возможности описывать все эти методы.
Стандартные протоколы описаньс в пособиях ВаспЬгоой ег а1, 1989 (русский перевол первого издания Манпатис и с)р., 1984); "Клонирование ДНК. Методы'*, 1988; "Новое в клонировассии ДНК. Методы"„1989; "Плазмиды. Методы", !990: "Методы молекулярной генетики и генной инженерии", 1990; РегЬа!, 1988; "КссоспЬ!пап! И'!А щссйос!о!ойу",1989; /уз)с!пс1, Всптасе!и, 1989. Глава 8. Оиеиации ии лОК 241 Подготовка фрагментов ДНК для клонирования Фрагмеьггы ДНК, предназцачснныс для клонирования, получают химическим и фсрмснтативным синтезом, гидролизом клон ируемой ДНК рестриктазами и другими эндонуклеазами, дроблением ес гидродинамичсским способом или ультразвуком, Подбором условий в определенных пределах можно задавать их длину, но в ряде случаев в зависимости ог емкости векторов и необходимости их эффективного использования фрагменты ДНК перел клонированием фракпионируют по размеру.
Образующиеся двунитевыс фрагменты ДНК облалают разными концами„что определяет выбор метода их присоединения к векторным молекулам. Если фрагменты синтезированы или получены воздействием рестриктаз, концы их могут быть ровными (тупыми) или липкими. Фрагменты, полученные в результате неспецифичсского дробления ДНК, имеют на концах случайные однонитсвыс участки. При этом разрывы распределяются по молекулам случайно, так что срели образовавпшхся фрагментов ДНК всегда содержится любой из генов в неповрежденном виде. Это особенно важно при создании банка генов. Расщепление ДНК рестриктазами„естественно, носит неслучайный характер. Если в клонируемом гснс имеется сайт узнавания используемой рссгриктазы, то ведут ограниченный гидролиз ДНК, чтобы не разрушить этот ген. Для получения полной или частичной геномной библиотеки проводят тотальное (валовос) клонирование всех выделенных фрагментов ДНК.
Такой способ клонирования называют также шотган (айоГ-йпп)-экспериментом. В случае же конструирования рскДНК, содержащей определенный ген с некоторыми известными характеристиками, фрагмент пы ДНК, получаемые под действием рсстриктаз, разделяют с помощью электрофорсза в агарозном или полиакриламидном ~елях. Если размер фрагмента, несущего нужный ген, неизвестен, его нахолят методом гибридизации по Саузерну (см. приложение). Для злого разделенные фрагменты ДНК переносят из геля на нитроцеллюлозпый фильтр, гибрилизуют с радиоактивным !'НК- или ДНК-зонлом к нужному гену и подвергают авторадиографии. След па рс| гп еновской пленке указывает на положение искомого фрагмента ДНК в геле.
![](https://s.studizba.com/z.php?f=/templates/si/i/noavatar.png&w=100&h=100&t=1"){kind=avatar}
