Рыбчин - Основы генетической инженерии - 2002 (947310), страница 41
Текст из файла (страница 41)
Второй вариант разработан в лаборатории Сталя (Козепбегя ег а!., 1985). Препарат для упаковки — лизат, полученный индукцией теплом лизогена с профагом Лс) г» сов2 гед хув! 5апз7. Упаковке т иго эцдогенной фаговой ДНК в головку препятствуют лелеция сов-сайта (соз2), а также мутация х!х1, блокируюшая исключение црофага из бактериальной хромосомы.
Остальные му1 ации играют гу же роль, что и в первом варианте. Упаковку Л ДНК осушесгвляют в присутствии АТР. Как было выяснено, необходимое и достаточное условие для упаковки— наличие в молекуле Дг!К двух сох-сайтов, ориентированных в одном направлении и разделенных 36 — 52 т.п.н. Поэтому субстратами для упаковки являются кольцевые или линейные димеры и более высокие олигомеры Л ДНК; мономерные молекулы не упаковываются ни (н 14ао, ни и| г!гго. Эффективность упаковки молекул ДНК с минимально возможной длиной (около 36 т.п.н.) на два порядка ниже„чем у ДНК фага дикого тьша. Чтобы избежать этого осложнения в буфер добавляют поликатионные амины— спермидин и путресцин, повышаюшие гибкость молекул ДНК.
Вслед за процессом упаковки происходит сборка цело~о фага: к зрелым головкам (структура 1У) присоединяются готовые хвостовые отростки, присутствующие в лизатах. Векторы, созданные на базе ДИК нитевидных (!)агав. Ьлизкородственные нитевидные колифаги М! 3, П и Гд обладшот однонитевой кольцевой ДНК, состояшей из 6,4 тыс. нуклеотидов, и имеют ряд свойств, позволяющих использовать их в качестве векторов. Во-первых, в их ДНК между генами П и Л'(см. рис.
4.12) есть мсжгенный участок (спейсер), в который можно вставлять чужеродные гены. Во-вторых, размер капсиды зависит от длины упаковываемой молекулы ДНК, по позволяет клонировать фрагмен- ты ДНК размером до 15 тыс. нуклеотидов. В-третьих, они образуют фаголизаты с высокой концентрапией (до 1Оц частиц в 1 мл) и, таким образом„позволяют получать большие количества векторной и клоцируемой ДНК. Преимушества однонитевых векторов являются следствием особенностей развития нитевидных фагов, описанных в гл. 4. 7! 4 Часть И. гьвлая ш~женерия гв Ыгго 1енно-инженерные операции с олнонитевгями векторами и ~ ~роцелуры по их конструированию ведутся, конечно, с использованием лвуьвпевых репликативных форм !Ргг ) ДНК.
Созлание подобных векторов сволится к введению в спейсеры единичных сайтов рестрикции, а также селективных маркеров. Основная особещюсть этих векторов — возможность работать с ними и как с плазмилами, используя РФ ДНК, и как с фатами. Доступность клонируемых генов сразу в одно- и лвунитевой формах значительно облегчает их структурный и функциональный анализ. Получение клонированных генов в олнонитевой форме необходимо лля секвенирования генов по Сзнгеру, лля саит-специфического мутагенеза (см.
гл. 8) и для приготовления гибрилизационных зоилов. Главныи нелостгпок олнонитевых векторов — нестабильность клоцируемих в них чужДН К, обусловленная тем, что фаги с большими вставками развиваются медленнее. Поэтому уменьшение их длины является фактором селекции. 1Нирокос распространение получили векторы серии М13тр, созланные в 1977 — 1983 годах в лаборатории Мессинга (см.
обзор МеЫпК, 1983), в которых селективный признаком лля отличия вектора от рекДНК служит феногип 1.ас или 1 ас трансфицированных клегок. Эти векторы содержат Ии1П-фрагмент (ас-оперона, внелренный в спейсер между П и 7!'генами фага М!3 через 2!ггпу-сайт и модифицированный так, как это описано ранее в ланной главе. Для провецения селекции по эффекту а-комплементации рециниентный штамм должен солержать лелеционный вариант lасУЛМ!5 гена !3-галактозилазы и Г-плазмилу !тля обеспечения алсорбции фагов на клетки (например, штаммы ЗМ103 и ХВ127„ см.
табл. 7.1). Мутация !вс!з приволит к 10-кратному повышению синтеза !.ас-ренрессора, полностью предотвращая экспрессию клонируемого гена, когда она нежелательна. Ввеление в бактерии векторов типа М ! Згпр осуществляют трансфекцией клеток Е сой кальциевым метолом„причем лвунитевая ДНК трансфицирует более эффективно, чем олнонитевая. В зависимости от условий трансфицированные клетки выявляю~ как инфекционные центры, образующиеся на газонах чувствительных бактерий, или как бактериальные колонии. Поиск рекД1! К прел- почтительнее вести среди инфекционных центров, так как их выход на порялок выше выхода бактериальных клонов, что обьясня- Глава 7.
Векяюры для «яинирияииия в баяли рияк 215 ется пониженной жизнеспособностью кальцинировапных клеток. Клетки, инфицированные нитевидными фатами„продолжают делиться, поэтому из негативных колоний можно вьщелять жизнеспособные клетки, содержащие фаги. Векторы серии М ! Зщр отличаются только пол илинксрами, по дает возможность использовать при работе с ниии универсальные, праймеры, в которых послеловательность нуклеотидов комплсментарна участкам покуса !ась.', находящимся на расстоянии нескольких нуклеотилов от полилинкеров.
Для секвенировання особенно удобны парные векторы, в которых одинаковые полилинкеры противоположно ориентированы. Пример таких векторов— векторы М!31пр18 и М13щр!9, длина которых составляет 7249 п.н., а полилинкер длиной 54 п.н. солержит 1О сайтов рестрикции лля 13 различных рестриктаз (см, рис. 7.4,г, д). Если каждый из таких векторов обработать двумя различными рестриктазами, то фрагмент чужДНК с совместимыми концами будет встроен в них в противоположных направлениях. Это позволяет определять его нуклеотидную последовательность с обоих копцов по разным нитям с помощью одного и того же праймера. Конечно, можно определять нуклеотидную последователыюсть клоцированного фрагмента с обоих концов, используя только один вектор, но для этого придется выделять РФ рекомбинантного фага и использован ь два стандартных праймера (см.
гл. 8). Гибридизационные зонды готовят также с помощью стандартных праймеров, которые направляют синтез (-)-нити в среде с радиоактивными с0ЧТ!' в сторону ог клонируемого гена (см. рис. 7.4рх д). Синтсз осуществляют в таких условиях, которые позволяют сохранить клонируемый' ген в однонитевой форме и использовать всю молекулу в качестве зонда. По результатам гибридизации зонда с двумя разными однонитевгами рекДНК, содержащими один и тот же ген, можно сделать вывод о различной (или одинаковой) ориентации этого гена в анализируемых рекДНК.
Гибрилиые век щры К гибридным векторам условно относят векторы, которые сочетают в себе все или отдельные свойства плазмидных и фа1овых векторов. 2!б Часть!!. 1)ннов ипаеенерил а! р!рго Фагмиды. Фагмгц!ами называют плазмилные векторы, содержащие оп'-сайт нитевидных фатов. Из векторов этого типа наиболее часто используотся плазмиды серии рЕМВЕ (13епте е! а!., 1983), рЬС118/! 19 (см. рис. 7.4,б; Ъ!е!га, Мезз(пй, 1987) и В!нелспр! М! 3 (рис. 7.8; Я!тог! е! а!., 1988). Они образованы внелрением в векторы р(ЗС фрагмента ДНК фага (! или М!3, содержащего сайт рас, необходимый для морфогенеза фаговых частиц, и сайты ог!(+) и аг!( — ) (см.
рис. 4.!2). Как и при использовании векторов р(3С и М13!пр рекомбинантные фагмиды распознают по изменению окраски негативных колоний на чашках с Х-Ва!. а) и () мск бк в) и мск кя оп(с) Т7а) тт оп(а! | !аск' Крл! оп(-) !„~р /с, *.! хьо! и нха! Ар, р! вал в н! В!власа'р! ' д!лаи!, яра В!псасирс Р! якР!!3-! ) ' в яу ' кз(мтз+) 1л, !ас рас! (З рв ппаа ) !ас!~ Всош гс 96 т.в.в.) ! !ас!~ гг ) Раа ц!лдл! оп )вапн! Ё-.. Рис. 7.8. С!роение векторов В1оезспр! М!3 — (а) и В!осзспр! М13+ (б).
Векторы М13- и М13+ отли !аются направлением ог!-санта, взято!о у фага П, и, соответственно, тем, какая пить вектора будгп упакована в фаговую корпускулу. Буквы ВК (Лас! -> йрв!) и КБ (Кри) — > Лас!) в названии вектора указывают на ориентацию сайта поликлонирования МСБ. Стрелки в МСЬ указывают на направле- ние транскрипции с фаговых промоторов Т3 и Т7 В присутствии фага-помощника Г1 (или М!3) фагыиды, используя сайг ог!(+), начинают реплицироваться как фаговые ДНК, образуя однонитевые копии плазмид, причем выбор нити для копирования зависит от ориентации оп'-сайта. Образовавшиеся олнонитевые ДНК могут упакогяяваться !и р!га в капсулу и одновременно с фатом-помощником покидать естественным путем клетку.
В препаратах однонитевых ДНК, вьщеленных из фатов, присутствует смесь ДНК фага-помощника и фагмид. Для большинства задач (секвенирование, приготовление зондов, ыутагенез и т. п.) 1 лава 7. йекон~ри дяя кяооироваиия в оаквгериях 217 это не препятствие, так как для этих целей используют специфические праймеры, не соединяющиеся сДНК фага-помощника Доля фагмидной ДНК в препаратах зависит от структуры ог1-сайтов фагмиды и Фага-помощника. Она низка у рЕМВ1. (1 — 10%) и повышена у рИС118/119 (10 — 50 %). Таким образом, с помощью фагмид клонируемый фрагмент может быть получен и использован в одно- или двунитевой форме.
Их преимущество перед векторами М13шр — возможность клонирования в них относительно больших фрагментов ДНК (до 1О т.п.н.), не полвергаюшихся внутренним перестройкам. Космиды. Как уже отмечалось, емкость векторов, полученных на базе ДНК фага Л (не более 23 т.п.н.), ограничена тем, что сущесзвенную их часть сосгавляют гены„кодируюшие структурные белки фа1а.
Как выяснилосгь в головку этого фага может упаковаться любая ДНК подходящего размера (36 — 52 т.п.н.), ограниченная лвумя сов-сайтами, ориентированными в олпом направлении. Это позволило, совместив в одном геноме плазмидный репликатор и соя-сайт фага Л, создать векторы нового типа, так называемые космиды (СоП1па„Но11п, 1978). Размер космид в среднем составляет 5 т.п.н.„что позволяет с их помощью клонировать ДНК размером до 45 — 47 т.п.н. Поэтому космиды предназначены лля конструирования банков генов. Космиды фактически представляют собой автономные совсайты. Использование их для клонирования генов основано на том, что в линеаризованной форме они могут присоединяться к обоим концам фрагментов чужДНК и образовывать структуры типа конкатемерных молекул ДНК. Такие молекулы способны упаковываться т 1луго в головки срага Л, если, конечно, сов-сайты находятся в олинаковой ориентации и размер ДНК между ними не превышает 52 т.п.н.
![](https://s.studizba.com/z.php?f=/templates/si/i/noavatar.png&w=100&h=100&t=1"){kind=avatar}
