Рыбчин - Основы генетической инженерии - 2002 (947310), страница 39
Текст из файла (страница 39)
Компетентность клеток можно вызвать„цолвергнув их действию кратковременного электрического импульса, что приволит к появлению пор в клеточных стенках, пропускающих ДНК вну>рь клетки. Отсюда и название этого метода — электрогюрация или электротрансформапия. Первоначально он бьш предложен для эукариотических клеток (1яецшапп ег а1., 1982), а затем исслелован и применительно к клеткам Е.
сай (Ро>иег ег а1., ! 988). В последнем случае было найдено, что максимальная эффективность трансфюрмации (3«10' трансформантов на 1 мкг ДНК рВК322) лости>ветел, 204 Часть!1. Галлая и»жене>>ил ьл г>гго когда после импульса выживает 30 — 40% клеток. При этом существует обратная зависимость между величиной напряжен> юсти электрическо> о поля н продолжительпостьк> импульса, которыл> подвергают клетки. Доля трансформированных клеток линейно возрастает с увеличением концентрации добавляемой ДНК. В оптимальных условиях ло 80 % клеток становятся "компетентными*' для электротрансформации. Процелура трансформации заключается в следующем. Клетки в логарифмической фазе роста концентрируют ло 4 х ! О»> клеток в мл в охлажленном 10 %-ном растворе глицерина, добавляют к ним ДН К, после чего смесь, находящуюся в кювете шириной 0,2 см, подвергают электрическому импульсу напряженностьк> 12,5 кВ>>ем и продолжителыюстьн> 5 мс.
Далее клетки немедлсн>ю переводят в питательнук> среду и после аэрации в течение одного часа при 37 С высевают па чап>ки с селективной срелой. Недостаток метода элею ропорации — существенная зависимое>ь эффективности трансх)х>рмации от размера т1>ансформирук>щей ДНК, а для болыпих молекул ДНК появляется также зависимость от используемого ппамма.
Для лучшего из шшммов Е со(1 (ЛН)ОВ) эта величина снижается от 2 3х 10' колоний на 1 мкг ДНК ши плазмид размером 7,3 т.п.н. до 1,2 ><10' для плазмид размером 240 т.п.н. (%ела ег а!., 1995). В пересчете на эквимолярпые соотношения эффективность уменыпилась в 50 раз. !'акил> образом, прн электротрансфг>рма>щи клеток смесью плазл>ид, например, при получении банка генов (см. гл. 9), большие плазмиды булуг недопредставлсны. Вактсриальные клетки, утративп>ие свок> стенку частично (сферопласты) или полностьк> (протопласты), но сохранившис цитоплазматическую мембрану, также мож> ю использовать для трансформации. Олнако у грамотрипательных бактерий этот метод нс получил распространения из-за сложности строения клеточной стенки (см рис.
10.2). Штаммы Е. со(> К-12, наиболее часто ис»ользусмые в качестве реципиентных клеток, перечислены в табл. 7.1. Характерная особенность их — наличие л>утации АЫК или 7>зг>>5 в клетках, которые предназначены лля ввслеция в ннх чужДН К. Эти мутации блокируют клсточ»ук> систему рестрикции и предохрапяк>т тем самым клонируемые фрагменты от действия рестриктазы ЕсоК. Глава 7. Векторы дяя кяонвроаокия е бактериях 205 Фаговые векторы Напомним, что фаговые векторы ко! !струируют на базе ДН К фагов с таким расчетом, чтобы в них сохранилась информация, которая обеспечивает сборку ги о!оо фаговых частиц.
Для клонирования в клетках Е. сод такие векторы разработаны на базе ДНК фатов Л и М13. В первом случае фаговые головки имск>т строго определенную геометрию, так что векторы способны включатыакое количество чужДНК, чтобы образовавшиеся рекДНК могли упаковаться в головки фага. По этой причине век горы характеризукзтся своей емкостьк!. Для нитевидных фатов, к которым относите!! М13, понятие емкости пе применимо, величина ю!о!!ируемой в них ДНК определяется требованиями эксперимента к стабильности фаговых частиц.
Векиюры, скоггсгиууирооагигые иа ос!!оке ДНК фага Л. Фагу Л самой природой была уготована роль переносчика чужих генов т о!оо (см. гл. 4) и ги о!гго. Действительно„в середине его генома имеется область, несущественная лля развития фага (см. рис. 4.1). Она замещается на бактериальпые гены при образовании трансдупируюших фагов (см. рис.
4.3) и она же используется для внедрения чужДНК в вектор методами и! о!гго. Фаговые векторы подразделяются на векторы внедрен ия и векторы за мешен ия (рис. 7 6). Первые несут один сайт узнавания лля избранной рестриктазы, поэтому у пих, как и у плазмидпых векторов, ллина рекДПК равна сумме ллин вектора и клонируемого фра! мента, Векторы замещения имеют лва сайта узнавания лля исгюльзуемой рестриктазы, поэтому в такие векторы клонируемые фраглзенты ДПК вставляют вместо участков, ограниченных данными сайтами. В обоих случаях в реакциях образования рекД11К участвуют два фрагмента Л ДНК (левое и правое плечи векторного генома, имекнцис на одном из своих концов сох-сайт) и фрагмент чужДНК. Под действием лигазы благодаря сох-сайтам прежле всего объединяются разные плечи Л ДНК.
Затем образовавшиеся векторные молекулы реагируют с чужДНК и друг с другом, формируя конкатемеры. Они явля!отея субстратом при сборке фаговых частиц и! о!гго (см. с. 212). 206 '1асть КС Генная инженерия ан щ(ео Левое тисни Несу>псетвспнаа область Правое плечо Ь>в1 1ыпввт Ст>остап 1 Ь2 «ппв те>ивет не1 по О Р ып с 5 Р. Геп.карта а А ~ В ~ С ~ О ( Е !Р Рестрпвтм Векщры5 замещения -я (пщ т = Хяп >лтС )' ' — ' '' (пп>5) — ааЬХС (пЮ Лап Х — -- П''"'а>,РР 1а (и!пЯ вЂ” — 1 781 влспрспзтв а( )-"--- — -------(щп5)"-". Ха> — ( Ь527 ) - — — - — — ! >434 '.
-- - - — - - ха>10 -) !вс5 ) ( ) -- —. - - — сав -- — - (щп5) а ха>11 Рыс. 7.6. трагсные векторы заа>еи(еиия и внедрения, сконструированные на основе ), ДНК для клонирования ЕспК(-фра>ментов. аа — Его!-сайты; А — Р— ЕспИ-рестрикты ), ДНК; ( ) — делении; Π— вставки; 1434 — вставка покуса иммунитета фага 434 При работе с векторами заме>цеция после их расшеплеиия рестриктазами Возникает проблема с буФерными фрагментами, которые в процессе клонирования могут снова вставляться в вектор вместо чужДНК, уменьшая тем самым Выход рекДНК.
Проблему решают очисткой векторных плеч: 1) используя цреиаратианый электрофорез в 0,5%-ном агарозиом геле или 2) цеитрифугируя В градисцте плотности сахарозы или )чаС1. Эффективность очистки поаышается, если предусмо>рема возможность расщепления буферных фра> ментов действием какой-либо иной рестриктазы. Другая аозможиость — дефосфорилироваиие 5'р-коицоа плеч вектора а местах "разреза*' и буферных фрагментов, что цреЛотарашает их лигироааиие (метод описан а гл. 8). В этом случае ДНК предварительно иыдержиеак>т один час при 42 С, позволяя гшсчам объединиться через сне-сайты и предохраняя их тем самым от действия шелочной фосфатазы.
Де(1всц>орилироеацие 5'р-коц!(оа ДНК в местах "разреза" применяют и при использовании векторов ансдреция с пельк> прсдотарац!сция самолигироааиия плеч вектора. Глана 7. Бектвяы длл клавлровинил в бал аерилх 207 Емкость фа гового вектора, т.е. теоретически наибольший размер чужДНК, вставляемой в него, вычисляется как разность между максимальной величиной молекулы ДНК, упаковываемой в головку фага 7, (она равняется 52 т.п.н.), и минимальной величиной генома фага„необходимой для его развития.
Последняя, в свою очередь, подсчитывается как разность межлу ллиной ДНК (43,5 т.п.н.) и суммарной длиной областей, несущественных для развития фага. К ним относится область в центре генома между генами Уи )Уразмером (6 т п и. и область лгв между генами Р и 0 размером 3,5 тльн. Таким образом, минимально возможный размер векторов„сконсгруирова~ щых на основе А ДН К, 29 тльн. (43,5 — !6 — 3,5), а максимальная величина вставки (теоретическая емкость) 23 т.п.н. (52 — 29).
Реальная емкость вектора определяется не только его размером, по и минимальной величиной ДНК, которая может упаковаться в фаговук~ головку (36 т.п.н.). Поэтому вводятся понятия максимальной и минимальной емкости фаговых векторов. Под мими понятиями подразумевается максимальное и минимальное количество ДНК, которое можно клонировагь в векторе. Эти величины определяются как разнощь, соответственно, между максимальным или минимальным размером уцаковываемой Д! (К и суммарным размером плеч вектора.
Например, если у вскгора сумма плеч равна 34 т.п.н., то в нем можно клоннровать фрагменты ДНК размером от 2 (минимальная емкость) до (8 т.п.н. (максимальная емкость). Отметим, что если в последнем примере вектор является вектором внедренна, то он не образует жизнеспособных фагов, а рскДНК, сделанная на его основе, образует. Это обстоятельство можно использовать как фактор прямой селекции рекомбинантных фагов, несущих вставки чужДНК.
Отбор фагов, содержащих только рекДНК, велут методом прямой нли непрямой селекции. Для и р я м о й с е л е к и и и удобно использовать фаговые |сны ехо, Ьег (совмесшо их обозначают че)хз гел) и лаги (см. табл. 4. ! ), присутствующие в буферном фрагменте. Метод основан на неспособности фага ). дикого типа развиваться в клетках с профагом Р2 (Яр!' фснотип). Те фаги„у которых произошла инактивация этих генов или их замена на гужДНК, развивак1тся в таких клетках. Напомним, что фаги ),гег( «алг не развиваются в гесл клетках и формируют лишь маленькие негативные колонии на 208 Часть 1!.
Редкая ллмеягдия гл пмо~ [азоне гссА* клеток (см. гл. 4). Поэгому лля повышения жизнеспособности рекомбинантных фагов в векторы полобного типа вводят сайт с!п, который служит "горячей точкои" гссА зависимой рекомбинации. В векторах внедрения д,|я генетической метки рекомбинантных фагов применяют гены ехо и с!, вводя в ннх сайты клонирования.
Фаги, имеющие во~анку в ген ехо, перестают развиваться в клегках с мутаггиями в генах ро!А илп !(», что и позволяет отличать нх от самого вектора. Внедрение чужДНК в ген с1 вызывает инактивацию фаз ового рспрсссора, в рсзут~ьтате чего рекомбинантцые фаги образукп прозрачные негативные колонии, так как они теряют способность лизола енизовать клетки. Для таких фагов возможна прямая селекция с помощькз бактсриального муганта !17! ()л81~ Ггеццепсу о(!узо8сгйвагюп), в котором фаги с геном с!' не развивакпся из-за 100%-пой лизо~ еннзанин нми клеток.
![](https://s.studizba.com/z.php?f=/templates/si/i/noavatar.png&w=100&h=100&t=1"){kind=avatar}
