Рыбчин - Основы генетической инженерии - 2002 (947310), страница 43
Текст из файла (страница 43)
Двунитсвая РгЭ фагмиды образуется с помощью бакгериальных белков и в отсутп вис фага П рсплицирустся благодаря плазмидному регщикатору. Размер вектора Л7АР 40,8 т.п.н., т. с. его емкость — ! 0 11 т.п.и. Векторы для клоиироваиия больших фрагментов ДНК Клонирование больших (50--100 т.п.н.
и более) фрагмснтов ДНК вЂ” важная проблема, поскольку при этом, во-первых, существенно облегчается создание гсномных библиотек (см. гл. 9), а, вовторых, удастся провести функциональный анализ полнгах больших генов или их комплексов. Действительно, многие гены эукариот состоят из несколь~~к сотен т.пль, а свособ!званым рекордсменом является ген дистрофина, чья транскрибирусмая область превышает 2 и пыл.н. Поэтому в последнее десятилетие были прелпри наты усилия Глава 7.
Векторы г)ля кловирования в баговерпях 223 по конструированию емких векторов. Сначала проблема была решена для дрожжевых клеток созданием искусственных хромосом УЛС (см. гл. 1!). Затем такие векторы были созданы на базе ДНК плазмидных профаг он Р! (РЛС вЂ” Р1 ан!Г!с!а! сЬгопкжогпе) и М 5 (г(ЛС— г!15 агйбсва1 сЬгоптозоп)е), а также Р-плазмиды (ВЛС— Ьас!спа1 апзТгс!а! сйгошозоптс). Векторы рРАС и р)ь(АС позволяют кюнировать свсрхкрупные, а рВАС вЂ” гигантские фрагменты ДНК (табл. 7.2).
Утогп )им, по названия УАС, РАС, ВАС и т. д. применяют для рек2[НК, а сами векторы обозначают рЪЛС, рРАС и рВЛС, Таблица 7.2 Возможноств непользования разных типов векторов прн клонировании в клетках Е. спй Векторы па базе Д((К Другпс векторы Операция Пааз- милн ЪЛС" ВАС Кос- лвын К!5 М13 Л Р! Клопвровапис сегментов Д1!К а) небольших (ло 10 т.п.п.) б) срелппх (10 — 20 т.п.п ) в) крупнгых (20-50 т.п и ) г) сверхкрупных (50-!00 тп.п.) л) гпгыггских (> 100 т.п.п ) Копструированпс библиотек: а) гепомннх б) кД1!К Экспрессия чужеролныл генов Ссквенировапие Сия газ гибрвлвзаггнопньа зоггаов Секреция чужеролпых белков * Дрожжевой вектор.
"* Прп наличии фагоспепифпческих промоторов. Векторы рХАС вЂ” пока единственные линейные прокариотическис векторы. Нри клонировании больших фрагментов ДНК лпнсйныс векторы обладают преимуществом перед кольцевыми векторами, так как эффективность образования рекДНК н этом случае выше (Янковскигг, 1989). В то же время следует учитывать, что в процедурах выделения большие линейные молекулы ДНК более ломки, чем кольцевые. !охр пР Кт ЯаоЗА я зл ЯанЗА БанЗА , нанти! Яса! Рйсаояная фосфатаза на~он! Р В/Б БЛЗ К Бса! ! Упакоаяа зп юцо т !схр Инзахоия а ансткн Цнркунярнзацня зп ато ! Мрхнппшякапня опр Кзпх Рис.
7. ! !. Схема клонирования больших фрагментов ДНК с помощью вектора рЛе!!О. В/Я вЂ” рскомбинантний сайт йатН!/ЯанЗА. Направление !охР-са!гга указано черной стрелкой 22 ! Часть 1!. Генная ннженерит! и Р!гпт !охр ! В! Н! „Я Ро : ~БЕЛИ!Иа! Чумссрсдная ДНК ф БанЗА Взрятнснтн тинной 75 - 95 т и н Глана 7. Вегапорн е>яя яяаяироеаяия в Лпктеряях 225 Отметим важную особенность репликоион, использованных для создания вышеупомянутых некторон: все они малокоиийны.
Это вызвано иеобхолимостью обеспечить стабильгюсть клонируемой ДН К. Известно, что с увеличением ес размера увеличивается вероятность сс структурных перестроек (делеции, всгавки, инверсии). Всроятиосп, понышается ио морс увеличения числа копий рекДНК, поскольку нсс более сказывается эффект мсжмолекуляр> юй рекомбинации. РЛС-клонирование. Профаг фага Р! (размер ДН К около 90 т.п.и.) стабильно рсплииируется в виде иизкокопийиой кольпсной плазмилы.
Размер области генома, отвечающей за илазмилнук> репликаиию, сравнительно невелик (несколько т.п.н.), а емкость фагоной голонки значительна (110 — 115 т.п.н.). Это лшю возможпосп сконструировать иа базе Р1 ДНК плазмидныс векторы с емкостьк> ло !00 т.п.н., способные совместно с клопиронаниой в иих чужДНК упаковынаться н голонки фага Р1 (Бгсгп(>егй, 1990). Базовый вектор рАг! ! 0 состоит из цнух областей, разделенных )ахР-са>пами, на которые лсйствует сайт-специфическая рскомбиназа Сге (рис.
7.11). Одну область составляют апьсайт плазмилы рВКЗ22, слинич> ~ый сайт Вас!, буфсрныи фрагмент из алеионирусиой ДНК и локус )>ас, огне.гсгвепный за упаковку Р ! ДНК. В другой области находятся плазмидный и литичсский рспликаторы фага Р1, селект>явные маркеры йлх и 'ГР и единичные сайты рестрикции ВашН! и Ва)1 (в гснс Тсе).
Плазмидный рсиликатор лслает вектор малокопийиым, а литичсский рсиликатор, находящийся под контролем (лс-рсирессора, при активации повышает число копий в клетке ло 20. Клонирование с помощью Р!-вектора осуществляется следующим образом. Векторную ДНК обрабатывают ресгриктазами ВаглН1 и Вас!, а также щелочной фосфатазой для предотвращения лигирования лвух образонаншихся векторных плеч (их размер 2,б и 24 т.п.н.).
Далее к исй добавляют геномиую ДНК, частично гидролизоваииую рсстриктазой 5аиЗА и фракпиоииронаинук> ло среднего размера 75 -95 т.п.н. Объслинсиис рестриктов ироисхолит по липким Вал>Н(/ВааЗА концам, так ч>о плечи Р1-вектора присослишиотся к обоим концам клонирусмой ДНК.
У>заколку рекДНК ведут н лве с>алии. Сначш>а ес "разрезают" н сайго рас ферментом иаказой (он солержится в экстракте дефектного Р1-лизогсна), а 226 Часть И. Генное иинселеиия ен итео затем добавляют упаковочную смссь, солсржап!ую головки и отростки фага Р1. ДНК упаковывается, начиная с рис-сайта, а момент окслшапия процесса упаковки подсказывается (в отличие от фага А) заполнением все!о объема головки, в рсзультепе чего оставшаяся часть ДНК "отрсзастсяс между произвольными нуклсотидами.
Рсконструированными гн тчгео фагалш инфицирукп клетки, солержащие фаговый ген сге. Продукт этого гена закольцовываст инъецированную линейную ДНК, если только в ней сохранились после упаковки оба!охР-сайта. Это делает возможной рспликацию рекДНК, обеспечивая выход Кел"-трансформантовло 10' клонов на ! мк! добавляемой ДНК (вектор + вставка). 1 сн Тес в рекДНК инакгивирован. Линейные векторы на базе пеазмесды 1Л5.
Профаг умсрсш юге колифага 7415 имеет уникальную структуру: оп является линейной ма,юкопийной плазмидой с концевой шпилькой, замыкающей ковалентпо обе пити ДНК (Сварчевский, Рыбчин, 1984). В центральной части генома плазмиды 7415 находятся гены, ответственные за морфогенсз фаговой частицы. Уда |ение этих генов, ненужных для стабильного поддержания ~иазмилы, позволяет уменьшить ее длину с 46,3 до ! 3,6 т.п.н. В мипиплазмилы )Ч15 были ввелены селективпые маркеры, соцержашие елингтгвенныс сайты рестрикции, что впервые привело к созланию линейных плазмилных векторов (Вострое и др., 1992, рис.
7.12; Равин, Равин, 1994). Клонирование ведут станлартными методами. Тсстировапная емкость этих векторов — 50 т.п.н., но, предположительно, она может быть повышена до 100 т.п.н. и более. Рссц Вша! гесс! Ф сс! сетя шс |хша( ~сшх ! сш Рис. 7.12. Строение линейного вектора р1Л3, сконструированного на базе репликатора плазмипы 1Ч! 5.
Функции генов и обозначения см. на рис. 3.!7 ВАС-клонирование. Идея использовать Г-плазмилу для клонирования больших фра!ме!ггов ДНК основана на хорошо известном факте существования Г-плазмил (см. гл. 3) размером ло 1 млн.п.н. Векторы рВАС солержат ген еерЕ и сайт ог!Б, которые Глава 7. оекторк г!ля клоннроеоння е оаягнеуиях 227 Бпла! вв!! обеспечивают с! о олностороннюю рен- н!яав! вяын! ликацию и контроль числа копий, а также гены рогАВ и сайт рагС, ответи>ян !пят т7 !зрь -ь),е нов г1! ствснныс за распрслслснис плазмидной ДНК по дочерним клеткам (см.
гл. 3, рис. 3.7). Первый такой вектор, рВАС1081., был снабжен маркером Сл!к и клонирук!!цим ссг- гяю е сп ментом (рис. 7.13). Носледнщ вклю- ( „в чал в себя: 1) сайты ). гоз)н и Р1 1охР вв'~с!ввь !7,3 х.п.н ! для разрезания рекДНК в опрслслснных положениях с помощью белков ' в 7, Тег или Р! Сгс с пелью сс физического картирования; 2) сайты НоиЛ11 и )Зал!Н1 лля клонирования Рис. 7.13. Строение векто- ДНК; 3) сайты (Вот)„Э711, Хта! и Лр.) Ра РВАС108Г„сконстРУ1!РоЛля вырезания вставок (Яз)тт!уа е! а1., ванного на базе РспликатоРа плазмилы Е 1992).
Клонирующие сайты фланкированы пролюторами фагов Т7 и ЗР6, которые позволяют синтезировать РНК-зонлы для "прогулок по хромосоме*' и прелосгавляют возможность ссквснировать ДНК на стыках вектор — вставка с помощью универсальных праймеров. ВАС-клонирование ведут следующим образом. Вскторнук! ДНК обрабатывают рестрикта:юй Вол!Н1 или Иле(! ! 1, а также щелочной фосфатазой лля прслотвращсния ес рециркуляризации (см. гл. 8). Далее к ней добавляют гсномную ДНК, частично гидролизованную той же рестриктазой и фракционированнук! ло средншо размера 100 — 300 т.п.н. Молярнос соотношение вектор: чужДНК при лигировании (400 елиниц ДНК-лигазы фага Т4, 12 ч при 1б'С) равно П):1. Трансформацию вслуг электропорацией, для чего используют клетки Е!Н10В (см.
табл. 7. !); трансформанты отбирают по их устойчивости к хлорамфениколу. В типичном эксперил!снтс образец, содержащий около 50 н! чужДЕ!К, позволяет получать 100 — 1000 трансформантов. Существенное преимущество ВАС-клонирования по сравнению с !'АС-клонированием — структурная стабильность вставок, а также повышенная в 10 — 100 раз час !ота трансформации, что позволяет экономить геномную ДНК. 228 Часть!1. Ренаая ипженеаан т иао Векторы-траисиозовы Иногда желательно, ггобы чужДНК находилась в составе клсто'шой хромосомы. Например, если клетки (скажем, Рееийотапаз или ЛЬ1юЬ)ит) предназначены для использования в природных условиях, то иьпеграпия клонируемого гена в хромосому позволяет предотвратить опасность его "утечки" в лругис виды бактерий.
Или, допустим, изучается ре)уляция ююиирусмого гена. Торца важно, чтобы ои сгабильио поддерживался в клетке в единственном числе. В таких случаях в качестве переносчика генов применяют модифицированные трансиозоиы, которые в свою очередь переносятся в клетки подходящими плазмилами или фатами. Векторам, которые перс- носят трансиозоиы, придают способность к "сал)оубийству", т. е. после цикла клеточного деления эти векторы элимииируются.
![](https://s.studizba.com/z.php?f=/templates/si/i/noavatar.png&w=100&h=100&t=1"){kind=avatar}
