Рыбчин - Основы генетической инженерии - 2002 (947310), страница 44
Текст из файла (страница 44)
Известно довольно много способов "самоубийства": тсрмочувствительиый характер реиликации, вкгоочение гена-киллсра (иапример, ген ЬВ у фага ) ) и т. л. У вскторов-транспозонов удалякп гены транспозаз, лишая их тем самым способности к самостоятельным псрсмегцсииям. На их место вставляется чужДНК. Сачи гены траисиозаз внслряют в векторы-носители транспозонов; ил1енно с их помощью транспозоны переносятся в клеточный геном.
После "самоубийства*' векторов-носителей рекомбинаитиый траиспозон остается локализованным в определенной точке клеточного генома. вгл нее! Большая серия векторов — минивав „. „неп в ю мр 'к " транспозонов Тп5, Тп10, Мв и лругих описана в руководстве Миллера (М)йсг, 1992). В качестве примера иривсдсле плазмиду р()Т/Кл1 (6,8 т.п.н.), несущую ротек траиспозонный вектор п)1п1-Тп5-Кп) Ар 1б,8лма) (рис. 7.14).
У траиспозоналслетирова- ны гены Ьтк и Втк (см. табл. 2.2), а ь Гкре) ген тра испозазы Ь)Р вынесен за ирсле- лы концевых инвертированных иовтоРис. 7Л4, Сгроение вектора- ров, состоящих из 19 п.и. Образовавшатранспсооиа пйвй-Тпз-К|о н яся конструкция через сайты 5аЛ и плазмиды-носителя рг)Т/Кев. )раницы мини-транспозона ЕсоВ1 внесена в плазмилн)яй векторвылелены черным прямо- носитель, в котором рспликатор взят из угольником плазмиды В6К, а ген тоЬ (обеспечение Глава 7.
Векторы для кяояироваяия е бактериях 229 мобилизации) — из плазмилы КР4. Эта плазмила используется лля переноса мини-транспозона коггьк7гацисй из Е. сол' в клетки Рзечи7отолак В них плазмида р(ГГ нс реплицируется, и поэтому конъюганты, отобранные по маркеру Ктв, солержат только транспозон, интегрированный в бактериальную хромосому. Сконструированы многочисленные варианты, в которых транспозонный вектор содержит другие селсктивные маркеры (включая гены !их), разные полилинксры, гены-репортеры для поиска промоторов и для образования рскомбинантных белков, локусы тоЬ лля придания плазмидам-мишеням свойства к мобилизации и т. л, ДРУГИЕ СИСТЕМЫ КЛОИИРОВМ1ИЯ Необходимость в разработке лругих систем юло~ ~ирования кроме клеток Е со!7 продиктована главным образом желанием использовать для производства генно-инжс~ ~ерных пролуктов традиционныс промышленные микроорганизмы.
К ним в первую очередь относятся грамположительныс виды бактерий, синтезирующие различные хозяйственно важныс вещества: бациллы (протсазы и амилазы), актиномицеты (антибиотики) и коринебактерии (аминокислоты, стероиды). Из грамотрицательных клеток отметим псевдомонады, способныс вести биодеградацию органических отходов. Векторы, предназначенные лля работы в друтих (кроме Е.
сод) системах клонирования, делают, как правило, челночными, придавая им способность реплипироваться дополнительно и в клетках Е сой. Это дает возможность использовать хорошо изученную систему лля начальных этапов конструирования рекДНК и ес размножения в количествах, лостаточных д7и трансформации исслслусмых бактерий, а уже экспрессию клонированных генов вести в исслелусмой системс. Основная трудность при разработке новых систем клонирования — отсутствие надежного способа введения ДНК в клетки. Плазмиды люгут просто нс проникать в клетку или разрушаться в ней клеточными системами рестрикции, они мо~ ут не обнаруживаться из-за отсутствия экспрессии репликационных или сслективных генов. Векторы грамотрицатеяьных бактерий, Применение описанных ранее векторов ограничено клетками Е со77 и такими 230 Часть 11.
Генная инженерия га г)ут близкородственными им энтеробактсриями, как 5аЬюле7!а, Ргогеиз и ХеггаФа. Векторы для других грамотрипатсльных бактерий конструируют, используя плазмиды с широким кругом хозяев, относящихся к группам несовместимости Р, Я и%. Как уже отмечалось (см. гл. 3), эти плазмиды рсплицируются почти во всех грамотрицательных бактериях, включая промышленно лажные штаммы АКгаЬаегепит, А;,огаЬасгег, Мегйу!арйг!их, МеГззегГа, Рзеиг)атолаз, КцаЬ7ит и др.
1-!аиболее характергпяе представители перечисленных групп— плазмиды И'4 (см. рис. 3.13,а)„ ВВР!О!О (см. рис. 3.13,6) и Яа (29,6 т.п.п.), соответственно. Плазмида КР4 имеет слинсп~енныс сайты рестрикции в своих сслсктивных генах Арн и Кглн, но из-за большого размера пе используется в качестве вектора. Вектором является, например, ее производная плазмида рВК2501 (рис. 7.15,а), у которой сеть сайты клонирования в генах Кт" (ХЬа1 и 7)йхПП) и Тсн (ЛаЛ), а также единственные сайты ЕсоК! и ЬКЛ1. У это~о вектора отсутствует способносгь к конъюгапии и мобилизации, поэтому его перенос возможен только методом трансформации (ТЪоптаз ег а!., 19Й). а) б) хтю1 Нйндд хьот Рис. 7.15.
Строение векторов рйК250! и рКР231, сконструированных на базе плазмид с широким кругом хозяев КР4 (а) и КБР1010 (б) Плазмнла ВЯГ1010 мульт икопийна, некоггьюгативна и невелика по размеру, но в се селективных маркерах нет единственных сайтов рестрикции, поэтому опа неудобна для клонирования генов. Для этой пели приме~ шют сс производные, их которых первыми были предложены векторы серии рКК Чаще все~о используют вектор рКТ23! (рис. 7.15, 6), содержащий единственные сайты ресзрикции Жю), Кии! и Оик!1П в гене Кглн (взят из транспозона ТпбО! 7903) „а также ЕсаИ и Глава 7.
Векторы дяя кяаиираеаиия е бактериях 231 .»т! в промоторпой области с ена 5т». Вектор рКТ249, имеющий селективные маркеры Ар», ЯР и Ят» и сайты клонирования Ееа(с! и Яя>1, является космидой, и поэтому для перничноп> отбора рекДНК использу>от клетки Е. сой (Ва8с)азапап ег а1, 1981). Преимупсество описьиаемых векторов сс>стоит в том, что нет необхолимс>сти делать их челночными.
С их номс>щью вначале можно осуществлять прелварительные операции по клонированию в хорошо изученных генетических системах (например, Е сс>1>', Р. рс>Ыа), а затем отобранными клонами рекДН К проволить трансформапяю клеток других видов. Нелостаток этих векторов — их нестабильность, которая вызвана тем, по гены, отвечающие за стабильпосгь, разбросаны по всему плазмидному > снаму (см. гл, 3) и часть из них отсутствует в векторах. Другой нелостаток — разный уровень экспрессии плазмияных генов в разных клетках, что влияет на число копий плазмил, уровень син> еза чужеролного пролукга и на эффективность выражения селекгивных маркеров. Конечно, конструирук>т и челночные векторы. Например, вектор р(>СР!8, сконструированный на базе г>лазмилы р()С18 и репликатора олной из плазмил Р. аегия>лоха, стабильно подлерживается в кише пюй па.'ючке и клетках пссвдомонас (Вс!»ие!хег, 1991).
Большинство >рамотрицательных клеток можно трансформировать после их обработки на холоду хлористым кальцием, но достигнутая эффективносс ь трансформации существенно ниже„чем у Е сс>й. Используют также трансс!>ормацию протопластов в присутствии полиэтиленгликоля.
Но наиболее универсален метол электротрацсформации (см. с. 203). Векторы Вас(Вих яиЬгВ1» Клетки В. ксс!>г>7>к, будучи почвенными микроорганизмами, обладают хороню развитым аппаратом секреции продуктов метаболизма и выделяют в ростовую среду такие промышленно ввкные ферменты, как, например, амилазы, !3-лактомазы, про>вазы и лр. Секреция чужеродных белков существенно облегчает их выделение и очистку, а, кроме соп>, иногда являются елинственным средством их спасения от деградации внутри клетки.
При создании системы клонирования лля В. кис>г>Вх первоначальные трудности были связаны с тем, что болыпинсгво ее плазмил не несет селектируемых признаков. Однако оказалось (Б)>г!!с!>, 1977), что некоторые мультикопийные плазмиды золотистого стафилококка, содержащие гены устойчивости к различным 232 Часть ВЧ >ея»ая лнаеенерия!и п>еа антибиотикам, способны трансформировать клетки В. хи6111126 стабильно в них реплицироваться и экспрессировать эти гены. К ним относятся плазмилы р(!В1!О (4,5 т.п.нл 7(>лк; см. рис. 3.15), рЕ194 (3,7 т.п.нц Ета), рС!94 (2,8 т.п.н.; Си>к) и рТ127 (4,5 т.п.нб 7еа). Кроме селе ктивных маркеров эти плазм илы обладают единственн ыми сайтами рестрикции и поэтому иногда использу>отея в качестве векторов.
![](https://s.studizba.com/z.php?f=/templates/si/i/noavatar.png&w=100&h=100&t=1"){kind=avatar}
