Рыбчин - Основы генетической инженерии - 2002 (947310), страница 48
Текст из файла (страница 48)
8.2). Далее кДНК и вектор с нужным полилинкером пшролизуют подходящими Гестриктазами КЕ1и КЕ2 и проводят лигирование образовавшихся фрагментов. Подобный метод был впервые апробирован при клонировании дуплекса кД11К гена ллобулина сх, (Копи, Мсог1спиж, 1931) лв 248 Часть П. тинная инженерил тн и!то Синтии ттутиккса кдНК Линкср гл !Л !.! Нукисата В! !л т,! Лиикср !.2 ы !.! ы та лн Рестриктжы Вп! и ЬЦ2 !.2 И Вспиивание в вектор Рскднк Рис. 8.2. Этапы клонирования кДНК методом двойных линкоров Линкеры используют также для объединения молекул ДНК, обладающих ровными концами неопределенного строения, с целью образования сайта рестрикции на стыке молекул.
Для клонирования больпгих фрагментов ДНК удобны линкеры, содержащие сайты узнавания для редкощепяп!их рсстриктаз, например, для !Ус!1 — 5'-АОСОСССССТ-3'. Разработаны и выпускаются гв частности, фирлсой 1л1етн Еп81апе! В1о1аЬ) линкоры для белковой инженерии. Наряду с сайтом рестрикции они содержат терминирующий или смысловой кодоны, вводимые таким образом в место стыка молекул ДНК. Тсрмицируюшие колоны позволяют в процессе трансляции проводить в супрсссирующих клетках запланированное слияние функциональных полипсптидных фрагментов.
Вставленные смысловыс колоны могут приводить к появлению в белках Глава 8. 0?гераиии па дНК 249 структурных особенносгей ((?-поворот, гидрофобность и т.п.) или аминокислот, способствующих летсрмицированной фрагментации рекомбинаптного белка (слг. гл. 10).
Примерами могут служить линкеры 5'-СТАЬСХ4И.,1 АО-3' (сайт для рестриктазы ?Цге1 и амбер-кодон), 5'-ТССССС66ЮООА-3' (Зп?и1 и колон лля пролина), 5'-САТСгСе1ХССАТО-3' (ор??1 и кодон для мстионица). Использовапае адаптеров. Алантерами называют одно- или двунитевые олигонуклеотиды, предназначенные д??я объединения молекул с несовместимыми концами. У луплсксов концы разные: один конец ровный, а другой ступенчатый, либо оба конца ступенчатые.
Адаптеры применяют, когда кош?ы векторных и клонируемых молекул образованы различными рестриктазами, а также когда в клонируемых фрагментах ДНК есть сайты используемых рсс?риктаз. Олнонитевые адаптеры применяют для объединения молекул ДНК с 5'- и 3'-выс?улающнми концами. Например, ко?щы, образованные рсстрикгазами ЕсоКУи Н)?а1, "состыковывают" с помощью Есой(- Н1?а1-адаптера: 5'-ААТТС6С6-3' алантер Есой!-Н1?и1 5'-ММ)лП~1)лПл) ХО-3' 5'-СММл) ?.1)лйл1)л?Ыл)-3' 3'-Ч~к()лП ~)Ч)лПМСГИА-5' 3'-6?С6Ч?')л1?"'Пл)1лПЧ1л1ХМ-5' ЕсоИ Н1?а1 ЦИНК-лигаза 5'-ХМч ?ч )чМл(С?АХГГС 6С6?СХХ)л1)ч?МлйлПЧХ-3' 3'-ХХ)чХХХХСПАА- -6С6ХМлПлПЧ)л1ХМл)-5' Есок1 Н/?а1 Возникающие нри атом пробелы (бреши) в двунитсвой структуре ДНК залолняются нуклеотилными ос.?атками гп ???го после трансформации.
В готовом виде имеются лишь ол?юнитевые линкеры и адаптеры (табл. 8. 1), причем фирмы пре?ь?ага?от также варианты с дсфосфорилированными 5'-концами. Последние используют лля предотвращения их самолигироваг?ия в опытах по клонированию. Двунизсвые адаптеры при необходимости получают комбинацией двух однонитевых адаптеров (а), двух лицкеров (б), адаптера и линкора (в): 250 с1асть Ги 1еааах сшжсеаерия о1 иоо ЕсоК1 Вта! 5'-ЛАП СССббб-У + — Ф ВатН1-Лсша1-адаспер 5'-бАТССССббб-3' Ват1Н Зта! Есок! 5 сАХГГСССббб-3' — -> 3'- бббССССТАб-5' Вта! Ваш Н! б) ЕсоК!-линкер ВатН1-линкер 5'-СССтЛХПСОСт-3' + 5'-ССббАТССС'С-3' 3'-СЗССТТЛАССС-5' 3'-С1(3ССУАббСС-5' 1ДП1(-лпгаза фага Т4 5'-СС()ЛАТТССзСзСС ббА ТСС(3(3-3' 3-СССПААбссб)С)ССУАббсс-5.
ЕсоК1 ВатН1 ! ЕсоК1, ВатН! 5'-ААТТСС~ССС6-3' ЕсоК1-ВатН1-алаптер 3'-ЮСТАС Б СС ТА б-5' ЕсоК! ВатН1 в) Ята1-липкер ВавН1-Ьла1-адаг1тер 5'-ССССбб-У + 5'-бАТСССССбб-3' — — — — ч ВатН1-адаптер 5-СССС)бб-3 У-СХХССССТА б-5' Всла1 ВатН1 Двунитсвые адаптеры с различными выступающими концами способны изменять выступа1ощие концы ДНК. Такие адаптеры называют конверсионными. Примером их может служить адаптер ЕсоК1- Бат) Н, с помощью которого Ваш!И-ко! щы можно заменить ЕсоК1-концами и интегрировать модифицированные таким образом Фрагменты ДНК в ЕсоК1-сайты векторов.
Иногда сайты узнавания для ресгриктаз, используемых при внедрении фрагмента в вектор, располагаются внутри этого фрагмента. В таких случаях данный фрагмент "вырезают*' с помощью других рсстриктаз, для чего па его концах создают соответствую- Глава 8. Операигш на ЛВК 251 щис сайты узнавания. Для этих целей используют адаптеры, содержащие такис сайты. Например, если вышеприведенный ВагпН1- адаптер испоггьзонался для встраивания фрагмента ДНК, обладающего ровш,гми концами и имсгощего в себе ВатН(-сайт, в такой же сайт вектора, то его можно "нырсзать" из рекДНК с помощью рсстриктааы Вта(: 5 6АТСССССЮ6)хПМх))х(Х 66АТСС ХМ>П>>г)х()х)СССС66з 3 3'-66х!СССТ (М%51)х)... ССТА 66...!нг)х))х) МхЛх)СТ*6ССССТА 6-5' Ват!И Вгла! Ват! И 5та! Вот Н! ,Ыта! 5'-С>66)х))х) )х))хПх)...
66А ТСС...)них))хПх)15(ССС-3' 3'-ССС)хПЧ Мх) )51... СС7А 66...)хПх()х))х))х))х)666-5' Бта! ВатН! Вта! Таблица 3.! Предлагаемые препараты лиикеров (Рготеаа) и адаптеров ()кои Еоа!аог) В!гг!аЬ) Линке ы Азиггеры Коггггекторный лгетод, Этот метод позволяет объединять любие днунитевыс фрагменты ДНК путем фсрментативно! о наращивания гга их концах однгигитевых комплементарных участков (рис. 8З). Именно с его помощью была сконструирована первая рекДНК (Зас1(аоп ег а!., 1972), положивпьая начало генетической инженерии. Суть дашин о процесса сводится к следукнцему. Фрагменты ДНК и линсаризованный вектор с концами любого с!роения обрабатывают экзонуклеазой фага ).
для "обнажения" 3'-концов. Это облегчает течение последующей реакции, когда терминальная дезоксирибонуклегггиди:прансфераза наращивает на Дат) П Есо)Ц Кого>ПП Кг»>1 Игг>1 Мог! г>>П 5пл 5)>га! Лог>! зг-П(СССАГССС)-З' 5са(СГ>СГ>ААТ 'ССС)-3' 5"-г)(ГЛЛСС ГГС)-3' 5еа(Г>Г>С ГЛССС) 3' 5еа(ССЛССССГГСС))-З' 5ег)ГПССССССССЛЛ)-3' 5' Л(Г>СГГ>СЛГ>с)-3' 5'->1(СС ГССАСС)-3' 5'-г!(СССССббС)-3' 5к>1(СГГГ. ГЛГ>ЛС>с)-3' Пати!отта! Паол 11.Х>>гп! Капп!-Л>г>г! Бик1 -5яа1 Еаоя1-Лт>г) НП>>Л!1-5)гк>1 Г(г>КЛУ-Хгоп1 >>гог1-Хг>>М 5аП-5>па( ЛЫ-Х>ггп! 5еа(сзАТСССССГ>б)-3' 5е>1(СЛ'! ССГ>ЛАГз>б>Г>Г>тТСС>)-3' 5еа(ЛАТТСССГ>Г>СГ>б>СГ) 3' 5'-а(ЛАТТСССГ>Г>б)-3' 5'-4(ААЗТСГ>ЛАССССТГСС>)-3' У 1(ЛССТССССС С)-З' 5>-4(ЛГзСТССААГ>ГзСГЛТСГз)-3' 5'-4(Г>СССС(>ААССССТ1 О з)-3' 5еа( ГСГзЛСССССГ>)-3' 5еа(СТЛСССЛАСС>СС>ТТСГ>)-3' 252 Часть И.
Генная инженерия нв игго 3'-концах фрагментов однонитевыс гом<пюлимсрныс участки из 10 — ЗО звеньев, используя добавленный в среду определенный дезоксирибопуклеозидтрифосфат. Если синтезированные участки у разных фрагментов состоят из комплсментарных нуклеотидов, то фрагменты могут объединяться с их помощью. В местах соединения фрагментов из-за неодинаковой длины гомополимерпых мхвостовн получаются однонитевые бреши или избыточныс однонитевые концы. Ранее эти дефекты исправлялисын Рггго репарационными ферментами — ДНК-полимеразой 1, экзонук-лсазой Н1 и ДНК- лигазой, после чего образовавшимися рскДНК трансформировали рсциписнтньге клетки.
Внгюр 1 ! г1г Реетрюаатв Фрагмент дак 5' з 3- ---,-- — 5. з Р Ф Э ° 5 ф Л 5' т 5 з 3' - . 5' ЙТТР ИГ Термюильна» трвгвьзсрваа гр алтр ттт . АААА 5'- — — -— -з 5' з 3' И'1 — — — — — - — — —. 5' 3'АААА 5' ~ Обьюнюение :='-'.:Э Зюонтллмна Лз 3ГЬ дйх-нолимерюа г1г днк-лигвла !'яс. 8.3. Схема сбъелипения молекул ДНК коппскторным методом Глава 8. Онер>в>»» на Я>Я 25З В настоящее время зтот метод значительно упрощен.
Во-первь>х, найдены условия, при которых концевая трапсфсраза ведет реакцию без предварительной обработки фрагментов ДНК зкзонуклсазой. Вовторых, операции по удалени>о избыточных концов или по заполнению брешей после объединения фра>ментов осуществляются ья ии> в самой трансформированной клетке.
Однако при использовании такого модифицированного метода снижается выход трансформантов. Отметим, что при применении коннекторного метода исключаются сцепление концов одной и той же молекулы и объединение одноименных ДНК. Это обеспечивает повышеш>ую эффективность образования рекД1 1К. Для выделения клонируемых фрагментов из рекДНК предложены различные способы, гюнованные на особенностях строения ОС- и АТ-коннекторов. Можно применять векторы.
![](https://s.studizba.com/z.php?f=/templates/si/i/noavatar.png&w=100&h=100&t=1"){kind=avatar}
