Рыбчин - Основы генетической инженерии - 2002 (947310), страница 45
Текст из файла (страница 45)
Однако, как уже указывалось, удобные для работы векторы имею> лва сслективных маркера, причем хотя бы в одном из них лолжен содержаться единственный рестрикционный сайт. Такие векторы были созданы на основе ряда выгвспсречисленных плазмид. Так, вектор р11*х'1! с сайтом клонирования Крл( сконсчруирован внедрением Н1лЛ11-фрагь>сита плазмиды рТ127, содержащего маркер Тск, в плазмилу рС194 через ее единственный П1>>е)Ш-сайт (рис. 7.16,а). Вектор рр(.608 прелставляет собой плазмиду рЬВ! 10, в которую вставлен>ен еаг(С>ья) из хромосомы В.
7>и»в1>гз(рис. 7.16,6). Экспрессия этого гена зависит от промотора фага В. з11ЬЛЫ Я'02, вставленноп> рядом через ЕеоЮ-сайт. Данный векп>р имеет в гене еаг единсп>снные сайты рестрикции -- Рз11 и Н(лВ1!!. Зтг> позволяет отыскивать среди нсомицинустайчивых клеток клоны, солержашис рекД11К, по их чувствителы юсти к хлорамфениколу. Интересно отметить, что в данной консгрукции промотор БР02 стал инлуцироваться в присутствии хлорамфеникола. Можно также инлупировать экспрессию внедренноп> через Н1ле/!11-сайт чужеродного гена, хотя ген са1 при этом будет инактивирован.
б) Бее Ееовг Вава н1па!и Рис. 7.!6. Строение векторов рНН1! и рР1.608, сконструи- рованных на базе плазмид рС194 (а) и рОВ!!0 (б) и предназначенных лля клонирования в клетках Л. еи61111е Глава 7. В<к>л<>ры <Э<я кл<>ни!х>кано>«> <>акл><7>а»х 233 Челночные векторы, способные реплицироваться в клетках Е.
св!< и В. п<Ь<<7<з, были впервые сконструированы Зрлихом (Е!><1!с!>, 197(!) и в лаборатории Степанова (Йомантас и <)7>., 1979). Через единствещ <ые сайты Н<п<11Н плазмида рВК322 была обьединсна в нервом случае с плазмидой рС1 94 (получен вектор р)ГЛ4), а во втором — с плазмидой р! 1!!110 (получен вектор р3310). Зти плазмилы трансформируют оба типа клеток, однако экспрессия их ге<юв неравнозначна. Гены С>л" и Ктк бациллярных плазмил проявляются как в Е. со!<, так и в В. х«Ь<йх, а ген Ар" экспрессируется только в естественном хозяине — в Е.
со!<, Зто явление вызвано большей специфичностью бапиллярного аппарата транскрипции-<рансляции (см. гл. 10). Недостатком ранних век<оров была их функциональная и с>3>уктурная нес<абильность. Функциональная нестабильность бы га вызвана тем, что использовались репликаторы, не спепифичныс для В..п<Ь«!и.
Репликатор, взятый из криптической бациллярной плазмиды РТА!060, существенно повысил стабильность векторов (! )аппа ег а!., 1987). Бирепликонный вектор рНР13 обладает всеми признаками современных векторов (рис. 7.17,а). Блок генов из <щазмнды р()С9 позволяет ел<у реплипироваться в клетках Е соВ и вести в них поиск клонов, содержащих рекДНК, по эффекту а-комгщементации. Селективные маркеры С>лк и Е>лх взяты из плазмид рС194 и рБ194, соответственно, поэтому они экспрессируются в обоих видах клеток. Единственные сайты Жсо1 и ВсЛ позволяют вести отбор рскомбинантов по инактивации этих маркеров.
Число плазмилных копий в клетках В. з«Ь<<Вх — 5, а в Е. соВ— около 200. На основе вектора рНР! 3 сконструирован вектор прямой селекции рНР59, которь<й позволяет отбирать транс<!юрманты В. «<Ьл7<з, солержащие только рскДНК (1!а<ща ег а!., 1990). Дополнительный элемент у этого век>>эра — консгитутивно экспрессирующийся ген сааб из хромосомы В. рил>И«<, который находится в одной трансляционной рамке с фрагментом!асХ' (рис.
7.17,б) и поэтому обеспечивает в клетках В..щЬ|<7<х синтез функционального «- пептила (1-галактозидазы в составе гибридн<>п> белка. Реципиентный штамм В. <иЬВ!В 6(> М ! 5 солержит мугантный ген !аазМ ! 5 пол конзролел< бациллярного промотора, что даст возможность использовать в этих клетках полилинкер МСБ для клонирования и отбора клонов с рскДНК по эффекту «-комплсмснтации.
234 Часть И. Генная нноеенерня ?п олго б) мсв оп Нсо! со? оП рввз22 вод оьв в Рис. 7.17. Строение бирспликонных векторов рНР13 (и) и рН?'59 (о)„предназначенных лля клонирования в клетках )). еногИе и Тн сод Структурная нестабильность (появление делеций в клонируемой ДНК) — следствие способа репликации использовавшихся плазмид. Репликация по механизму катящегося кольца сопровожлается образованием олнонитевых ДНК (см. рис. 3.15), а такая ДНК рекомбиногенна.
Выделение реплицирующихся в тета-форме плазмид рАМВ! из Я. !иееа!ьг и рТВ19 из ??. лйг?7?х позволило создал ь на основе их репликаторов векторы, стабильно клонирую- щие ДНК размером до 33 т.п.н. (?ап?н!егс ег а!., !990). На базе ДНК. умеренного фага Г105 (39,2 т.п.н.) сконструированы фаговые векторы, позволяющие клонировать чужДНК размером до 5 т.п.н. (3опеа, Егг)пИоп, 1987) и экспрессировать их (С)!Ьаоп, Е?т!пя?оп, 1992).
Принципы конструирования и способы клонирования сходны с теми, которые описаны для фага Л. Трансформация клеток В. хи?зиу!уь Как уже отмечалось, трансформируемость клеток В. еибг??ц — их приролное свойство, поэтому они легко гранс4юрмируются гомологичной бактериальной ДНК. Добавленная лвунитевая Д! ! К адсорбируется на поверхности компетентных клеток и под действием нуклеаз превращается в однонитевые фрагменты. В клетки проникает однонитевая ДНК размером около 10' нуклеотидов, которая путем рекомбинации замещает однонитсвой гомологичный участок хромосомной ДНК, нри этом почти каждый поглощенн?яй фрагмент ДНК интегрируется в хромосому. Частота трансформации линейно зависит от концентрации добавляемой ДНК в определенных ее прелелах. Это Глава 7.
Век>пори| длл клоиироваиия в до>иперилх 235 свидетельствует о том, что <>явой молекулы ДН К достаточно для успешной гранс4>ормации клегки. Нач|ц|ьные этапы процесса трансформации клеток бактериальной и плазмидной ДНК одинаковы, но во втором случае эф- <1>ективность транс<рормации (нефракпионированными препаратами плазмид) падаег в среднем на три порялка, причем она оказалась зависящей от степени олигомеризации плазмил (Сапов| «г а1, 1978).
'Гак, для мономерных кольцевых молекул <>на равна 40 трансформантам на 1 мкг ДНК, для димсрных — !О', а лля мультимерных — более !О'. Это объясняется зсм, что проникшие в клетки однонитевые линейные фрагменты мономерной щ|азмидной ДНК не могут образовывать лвунитсвые кольцевые молекулы, способные к репликации. Указанный недостаток усгранястся использованием лля > рансформации мультнмерных плазмид или созданием гд г<Уо условий для закольцовывания мономсрных однонитсвых ДНК.
В первом случае успешная трансе!>ормация обеспечивается повышенной вероятностью попадания в трансформируемую клетку таких однонитевых фрагментов, которые солсржат перекрыва|ощиеся и комплементарныс области плазмидной ДНК. Это может привести к образованию хотя бы частично луплицированных кольцевых молекул, способных к репликации, и к восстановлени|о целого или укороченного плазмидного генома. Мультимсрные формы плазмид получают лигированием смеси линеаризованн ых мономерных молекул.
Во втором случае эФФект (до 2 х 10" трансформантов на ! м кг ДН К) дости | ается наличием в плазм иле дупл ицирован ного участка (Бойцов, Голубков, !980) или участка, гомологичного бактериальной ДНК, а также присутствием в клетке другой плазмиды, имеющей областы омологии с трансформирующей плж>милой. В каждом из трех вариантов этого случая созлаются условия для рекомбинационного объединения концов линейных однонитевых фрагментов, для последующего синтеза комплементарной нити и образования нативной плазмидной ДНК. Разумеется, в этом случае для трансформации можно использоватьтолько Ксс' клетки. В качестве реципиентов можно использовать протопласты В.
хи<>ГИД, так как у грамположительных бактерий эффективно 236 Часть П. Ганна» ннженн»нн гн ><уха регенерируется клето шая стенка благодаря отн<>сительной просто<с ее строения. Транс<!>ормацию протопластов В. х«<><Ига плазмилной ДНК впервые осуществили Чанг и Коэн (СЬап8, СоЬеп, 1979). Как выяснилос>ч протопласты эффективно (ло 4х10' трансформантов на 1 мк> ДНК) трансформиру<отся в присутствии полиэтиленгликоля плазмилной ДНК любой <1>ормы, в том числе и мономернь<ми молекулами. Это указывает на различие механизли>в проникновения ДНК в клетку при трансформации бактерий и их протопластов.
Однако техника получения протопласт<>в сложнее, чем компетентных клеток, в связи с чем трансформацию прото<настов применяют только в нсобхолимых случаях. Например, если клетки дефектны по системам рекомбинации или слишком мал выхол мул<пимерных плазмилпых ДНК и реакпии ли>.ирования и т. и. !!еки<лры Яггерготуселл Грамположитсльные почвенные бактерии р<>яа Ягерг<>н>усах производят свыше 60% известных антибиотиков и облалают собственными плазмидами и фагами. Неуливизельно поэтому, по >ь и этих клеток лосгигнуг существе> <ный прогресс в разработке систем клонирования.
Векторы обы пю конструируют на базе низкокопийных плазмид БСР2 (30 т.п.н. из 5. сое!<со!ог) и ВЬР! (17 т.п.н. из Х !<н><(анх), а также мультикопийной плазмиды р1310! (8830 п.н.). Все плазмиды конъю<ативны. Однако у мультикопийных плазмилных векторов гены, отвеча>ошие за конъюгативность, обычно делетированы, чтобы избежать возможности неконтролируемоп> обмена рекомбинантными ДН К между клетками в смеси трзнсЧ>ормантов. В качестве сслективных маркеров использу><гг геп ы, обеспсчиваю<цие усгойчи вость клеток к различным антибиотикам. Наиболее распространенным маркером являезся ген !». (устойчивость клеток к тиострептону). Для клонирования в стрсптомицетах сконсгруироьчшы различные типы векторов: клонирующие, экспрессионные, космилные„интегративные и лр.
![](https://s.studizba.com/z.php?f=/templates/si/i/noavatar.png&w=100&h=100&t=1"){kind=avatar}
