Рыбчин - Основы генетической инженерии - 2002 (947310), страница 47
Текст из файла (страница 47)
Зтот фрагмент 242 х(асп Рй 7'еииая иижеиедии еи игш выделяют, экстра~нруя его из соответствующей зоны геля, кото- рую предварительно механически вырезают. Объединение фрагментов ДНК Нри объединении фрагментов ДНК возникают две проблемы -- глруктурная (проблема совместимости концов обьсдиняемых фрагментов) и кош [ентрациоппая (проблема соопюшения кон~ гентраций объедщшсмых фрагментов).
Непосредственное объединение. Ьсз предварительной подготовки лигнруют рсстрикты, имсю1пис совместимые концы — липкие или ровные. Липкие концы обьелиняются в результате комплсыептарпых взаимолействий с послслующим действием ДНК-лигазы (см. рис. 7.!). Фрагменты ДНК с ровными концами объединяют с помощью ДНК-лигазы фага Т4. Ввиду низкой эффективности этой рсакпии концентрации ДНК и фермента при зюм лолжцы быль на порядок вылив, гем при объединении липких кшщов. Если вскторпыс молекулы и чумДНК обработаны одной рестриктазой илн их изошизомсрами, то к.к)нируемый фрагмщп. можно "вырезать" из рекД11К с помощью тех жс рсстриктаз.
Ход операций по лиг ировапию контролируют элсктрофорезом в гслс. Лигирование молекул ДНК, обладаюгцих совместимыми концами, неизбежно сопровождается их пиркуляризацисй вследствие обьединения собственных концов, что снижает выхол рскДНК. Удачный выбор концепт)заций ДНК уменьшает влияние эт~~о фактора. Рассмотрим сначала шш простоты вариант, когда лигируюзся векторные молекулы. прслваритсльно линеарпзованныс рестриктазой.
Молекулу ДНК в растворе можно представить в виде случайного клубка, в котором один конец молекулы находится от другою па некотором срелпсм расстоянии, зависяшем от се длины. Среднее же расстояние от этого конца молекулы ло ближайших концов лругих молекул определяется концентрацией ДН К. В процессе лигирования объединяются два статистически близких друг к другу конца вне зависимости от того, какой молекуле опи принадлежат. Таким образом, идут параллсл ы ю две реакции — межмолскулярная, приволягцая к образованию конкатемеров, и внугримолекулярная, ведущая к рециркуляризации вектора.
Скорости обеих реакций и их результат зависят от соотношения указанных Глава 'ь'. Операции ап/!НЛ 243 выше расстояний. Для этих условий вполне очевидно, что: 1) при фиксированной длине вектора вероятность циркуляризации увеличивается с уменьшением его концентрации; 2) чем меньше размер молекул при постояшюй концентрации копцов/1!1К тем больше выход колы!евых структур. Из теории внутримолекулярной конденсации, развитой для полимеров и применимой для рассмгприваемого ларив~па„следует, что зависимость концентрации полимера ! (г/л), при которой скорости меж- и внутримолскулярной реакций равны, от молекулярной массы М в дальтонах выражается формулой) = 51,1 к М "'.
Согласно расчету, величина ) для векторов ), и рВВ322 составляет 1й и 32 мкг/мл, соотвегстве~шо, адля кДНК размером 1 т.п.н.— 63 мкг/мл. Согласно той же теории, если объединяемые молекулы имеют разные длины, то лучший выход достигается при их эквимолярных концентрациях. При значительном отклонении от эквимолярпости будут образовываться олигомеры преобладающего компонента. Рассчитаем условия для клонирования кДН К (1 т п и ) в велторе рВВ 322 (4„36 т.п.и.). Поскольку определявшей является концентрация меньшего фрагмента, возьмем величину 63 мю/мл, при которой половина молекул кДНК будет готова лля межмолекулярных взаимодействий. Эквимолярную концентрацию С вектора рВ)(322 подсчитываем из соотношения (С/гп) — ()/ш),, гдь ш — длина молекул в т.п.н.
Она будет равна 63 хв 4,36/1 = 275 мкг/мл. Отсюда ясна необходимость повьпленных концентраций обьединясмых молекул, когда вставка имеет пеболыпой размер. При клонировании фрагмшпа ДН К размером 5 т п и. в плазмидс рВК322 определяющей становится ее концентрация Эквимолярпая концентрация С чужДНК подсчитывается из соотношения (1/ш) „= (С/ш),„„. Она равна 32 к 5/4,36 = 37 мкг/мл. Реакции лигйрованшя проводят обычно в объеме 10 мкл, для чего требуется брать по несколько десятых микрограмма ДНК Если данные о концентрации и качестве ДНК неопределенны, то рекомендуется экспериментально найти оптимальное соопюшенис кош[ентраций лигируемых молекул.
Это замечание тем более спраВедливодля клони!ювания с использованием ). Векторов, поскольку в реакции лигировапия присутствуют два его плеча. В этом 244 Часть П. Генная инженерия ьн ейео случае следует провести предварительные эксперименты с молярным отношением вектор: вставка от 0,25:1 до 3:1, исходя из того„ что в пробирку добавлено 0,5 — 1,0 мкг векторной ДНК. Фрагменты ДНК с липкими и ровными концами встраиваются в соответствующие сайты векторов в любой ориентации, что неприемлемо для многих экспериментов, в часпюсти, в опытах по экспрессии клонирусмых генов. Когда клонирование необходимо проволить ориентнровацно, вектор и фра1 мент ДНК обрабатывают двумя рестриь газами так, чтобы у них образовались различные ступенчатые концы.
Это обеспечивает определенное расположснис фрагмента в рекДНК. Дополнительное преимушество этого способа клонирования — отсутствии циркуляризации молекул, что увеличивает выход рскДНК. Иногда циркуляризацию можно предотвратить, объединяя фрагменты ДНК, полученные действием рсстриктаз, образующих одинаковые липкие концы, но име|ощих разные сайты узнавания. Например, при лигировании смеси рестриктов Хта! (Се ССООЬ) и ЮЛоМ! (ОЗССООС) в присутсчвии соответствующих ресчриктаз ковалснтно обьединяются лишь разноименные ресгрикты, поскольку только гибридные сайты СССООС и ОССООО, образовавшиеся на их стыках, устойчивы к действию обеих рестриктаз. В рсзультаге фракция кольцевых молекул будет сосгоять исключительно из рскДНК. Клонирусмый фрагмент можно "вырсзатьн отсюда рестриктазой НраН (СьСОО), если в нем самом нет последовательности ССОС.
Следует учесть, что ДНК-лигазы работают только цри низкой ионной силе, поэтому этот способ применим лишь для небольшого числа пар рсстриктаз. Феряеелтаспивиая модие2тикацин концов. Модификацию концов лигируемых молекул ДНК проволят для разных целей. В частности, основнос средство предотвращения циркуляризации молекул — предварительная обработка щелочной фосфатазой Е сод мецыцего но размеру компонента (обычно это линсаризованный вектор), после чего концы таких молекул не замыкаются дру~ с другом лигазой из-за отсугствия у них фосфатных групп.
В то же время клонируемый фрагмент встраивается в векторную молекулу благодаря наличию у него этих групп (рис. 8.1). Оставшиеся дефекты в рекДНК устраняются рл ито после трансформации клеток. Глава 8 Операции ни,ЧНв' 245 вс к~ "Р 5е зо 5'О 3'О Высосав часеоса травсфор мал ив Рис. 8.1. Способ предотвращения рециркуляризации вектор- ной ДНК с помощью фосфатазы Частая процедура в молекулярном клонировании — переклонирование фрагмента ДНК, т.
е. сто перенос из одного вектора в другой. При этом обычно возникает проблема несовместимости концов фрагмента и нового вектора, которая решается несколькими способами. Ступенчатые концы фрагментов ДН К можно сделать ровными. Выступашший 3'-конец можно гидролизовать нуклеазой Я или нуклеазой из проростков золотистой фасоли. Но лучший резулалат достигается использованием 3' — >5' экзонуклеазной активности ДНК-полимсразы фага 34 в присутствии всех четырех 246 Часть!1 2еииая ииаивиерии га иив дсзоксирибонуклеозидгрифосфатол (гП !Т1').
Если выступает однонитсвой 5'-конец, го брешь заполняют с помощью кленовского фрапчснтаДНК-полимеразы 1, добавляя всреду необходимые ЖЛ Р. 1-!апримср, если фрагмент ДНК получен действием рестриктазы ЕсоК1, то достаточно добавить только г)АТР и с1ТТР. Полу шл распространение способ соззания липких концов частичным заполне! щсм концевой 3'-бреши с помогцью кленовского фрагмента ДНК-полимсразы 1, что достигается добавлением в среду только определенных г!ХТР (Нппа, 'тУепз1пк, 1984; х,аЬаготзку, А!1йсптег, 198б).
Так, оказывается возможным объединить, к примеру, Хаа1- и Нглс1!!1-фрагментьс АЪа) НтЛ11 ...ХХХХХТ-3' 5'-АОСТ РХХХХХ... ...ХХ ХХХАСАТС-5' 3'-АХХХХХ... 1 гП ГР Кленовский фрагмент ~ дАТР с!СТР ДНК-полимеразы 1 14СзТР ... Х Х Х Х ХТСТ-3' 5'-АССТТХ ХХХХ... ... ХХХХХАРПАТС-5' 3'-()ААХХХХХ лДНК-лигаза ...ХХХХХТСТАССТТХГ ХХХ.. ...ХХХХХАСАТССААХХХХХ... Этот способ можно использоваттч даже если в результате на кон- пах ДНК выступает по одному комплсме! ггарному нуклеотиду или по лва — три цуклеотила, один из которых нс имеет комплементарного "партнера".
Вылелсние клонируемых фрагментов из рекДНК, полученных этими способами, естественно, затруднено. В случае необходимости переклонировация используют векторы, имеющие в себе полилинкеры, или применяют линкоры и адаптеры. Итвльзоввиие ливкеров. Синтетические олигопуклеозтщы— липкеры и адаптеры применякп для объединения фрагментов ДНК, имеющих концы различного строения, и для введения специальных последовательностей в места соединения.
Линкорами назывщот однонитевые самокомплемснтарные олигопуклеотиды, которые образуют дуплексы, имеющие ровные концы и содержащие сайты рестрикции (выделены шрифтом): Глава 8 Оавраяв» АДИК 247 5 -ССаААТТСС) Г)-3' 5'-ССС~ЛАТТСГ) С-3' — — — — л 3'-(ТСС!ТЛАС~СС-5' 5'-СС(ТЛАТТСОС1-3' ЕсоК! Сайтов рестрикции в ли~ ~ кере может быть несколько: НраП НраП Н!доп1 5'-СССР. А ТССС6-3' 5'-ССЛАГ С7ТСГ3-3' 3'-ЬСССТАСССС-5' 3'-ГЖТУС6ААСС-5' ВоглН ! А/и! Линкеры с определенным сайтом рестрикции используют для присоединения фрагментов ДНК„имеющих ровные ко~ щы, к ступенчатым кон1 [ам вектора, образованным одноимснноя рестриктазой. Для зтого линкеры в виде дуплексов вначале "пришивают" с двух сторон к фрагмснтага ДНК с помоьцью ДНК-лигазы фага Т4, а затем обрабатывают соотвстству1ошей рестриктазои: ЕсоК1 ЕсоК! 5'-СССЛАТГСГ3 О-)л))л)Г П)Ч Х М Х ..)л! )л) ~ж й МлР 04-ССГ)ААТТСС) С~-3' 3'-СССГГЛАГ)СС-)лПМ !4)л) )4)4 ..)л))Ч ХМ ч)4Х! чОССТТААГ'СС-5' 4 ЕсоК! ЕсоК! ЕсоК) 5'-ААТТСС~ Г3-Г 1)ч )4 )л) 1Ч )л) )л!...
)л114)л! !лПлПл) 1Ч Х-ССС-3' 3'-ССС-Юч)ч )л! Х )ч1ч...Г4М)л)МХ'М)л!Х-СОСТТЛА-5' Далее фрагменты и векторы обьедиця|от через образовавцптеся липкие концы. Конечно, зтот способ непригоден, сели клонирусмый фрагмент солержит саит узнавания для той же рестриктазы. Присоединение разных линкоров к фрагменту и образование у него различных ступенчатых ковшов предотвращает его циркуляризацию и позволяет проводгпь его ориентированное встраивание в вектор Такая техника применима для клонирования кДНК. На стадии до обработки двупитевои кДНК нуклеазой Б! !см. рис. 6.1) к ней присоединяют линкер Г.!, а другой линкер 1.2 добавляют после действия атой нуклеазы !рис.
![](https://s.studizba.com/z.php?f=/templates/si/i/noavatar.png&w=100&h=100&t=1"){kind=avatar}
