Рыбчин - Основы генетической инженерии - 2002 (947310), страница 50
Текст из файла (страница 50)
Затем с помощью Д!!К-лигазы получали ковалснтно замкнутыс репли. кати1щые формы (РФ) фаговой ДНК, нуклеазой Я! убиралг незавершенные продукты си»гсза и трансфицировале сфсроцласты Е ео(1 С. В образовавшемся потомстве фагов от 1 до 40 % частиц (в зависимости от типа мутации) были мутанта. ми.
Выход мутантов можно увеличить до 100%, если суммарную ДНК, выделенную из фагов, повторно использовать для синтеза и Г)уео РФ с помощью тех жс синтетических праймсров. Объясняется это тем, что прн температуре 25 С праймергя гибридизуются практически только с мутантной одноцитевой ДНК. Поэтому при повторении процедуры мутагсцсза в потомстве фагов будут присутствовать лишь мутантные формы. Глана 3.
Операции на 21!за' 259 к .-к-- к Кненовекаа фрагмент ,дНК-ноаннеразы 1 ----- — —.-- — Э )! ' двк- !! ',Лнукнеазаа! 1) - -Э- !~ транефекпна Озпор ~ муна!тон рис. 8.6. Направленный сали-специфический мутагснсз с помощью синтстнчсского олнгонуклсотнда. х — место мутгн!ни Описанный метод по-прсжнему широко используется, в нсго внссспы лишь некоторые изменения. Во-псрвых, мутирусмый фрагмснтДНК ююнирустся в векторах типа М13тр, позволяющих выделение из них ато!о фрагмента в однонитсвои форма.
Во-вторых, выяснены условия для синтеза мутагшшого олигонуклсотида. Для осуществления точс шой замены сиптсзируют олигонуклсотид длинои ! 7-19 звеньев с заменяемым нуклсотидом поссрсдинс. Если заменяют, добавляют или удаляют лва или большсс число звсньсв, то в олигопуклсотидс по обс стороны от замены должно быть по 12--15 комплсмснтарных нуклсотидов. Копсчцо, чсм больша замспа, тсм мсньшс выход л!утантов. Например, всроятность получить деланию в нссколько согсп пар нуклсотидов в 50 раз меньше вероятности получсция точсчцой мутации.
В-трстьих, для прсдотвращсния рспарации неспарснпых основании, образовавшихся послс рау!ша рспликации зл р1гггь и возврата их к дикому типу для трансфскции бсрут кпстки Е. со!! с мутациями в генах азий., я!и!В илн тигН, которые осушсствляют этот тип рспарации. В- !ствсртых, поиск мутантной ДНК всдут методом гибридизации с исходным олигонуклсотидом в условиях (например, попижснпая температура), исключающих ого связывание с2!НК дикого типа. Мугированная ДНК нс отличается, 260 Часть И. Геннссн ссноненсрнн сн Гяио как правило, по фенотипу ат исходной„поэтому результат мутирования следует проверить секвенировапием. Выхол мутантов можно сущсствсвсо повысить, если до мутагспеза фаги М!3 вырастить в клетках Е.
со(с' с мутациями в генах с(иг и ил(с (Кшс!сс1, 1985). Эти мутации способствуют частичной подстановке в Д1!К лезоксиурилина вместо тимндина. сРаги с гаками подстановками не способссы развиваться в иссяс клетках. Таким образом, сели синтез /!!1К ьл сс)го вести в присутствии ЛТР, а образовавшимися гетеродуплексами трапсфицировать ипу' клетки, та в них разовьются только мутантные фаги — потомки от синтезированной сп пгго ~ппи. Лналос ичный метод основан на наблюдении, что некоторые рестриктазы (например, Аги!, стссссЛ1, )Усс), Рсг) и др.) не могут полностью расщеплять сайты, когда в них присутствует тионуклеотид (рнс.
8 7). Если синтез Д1(К сн успп вести в присутствии с%ТРа8, то указанные рестриктазы будут расщепля и, в образовавспихся гетеродуплсксах только родительскую нить. Последовательным действием экзонуклеазы И! и ДИК-полилсеразы эта нить ьв гсггостановится полносз ыо ком плсментарной мутантной нити (рис. 8.8). У Р а О О ма На Е О- Е О-Ес О ОН, О Осоованис О О 4~ ' и ОН Н Рис. 8.7. Строение и5-лезоксинуклеозилтрифосфата Идея вводить мутации с помоисью праймеров используется и с применением лсетода !1ЦР (см. приложение). В олгсолс из таких вариантов был эффективно осуществлен сдвиг рамки считывания на олин нуклеатид в сегменте гена (исг.
плазмиаы рВ!нелспр! И ВК' (Невка!еу ег и/., 1989). Мугация была зашифрована в праймсре 2 (рис. 8.9). После первого раунда репликации образуется линейный гетеродуплекс, а при пскледуюших раундах, накапливается мутаптная плазмила из-за большего сродства праймсра к изменешюй нити. Лигиравание восстанавливает целостность кольцевой молекулы в месте сгыка в 80 ое случаев. Глава 8 Операции ла/!!И' 261 х.
у Д!1К-поллысрсза йчтр, литра Б Д11 К-пслаысраха -Ф Рис. 8.8. Направленный саит-сг!сцифичсский мугагенез с помошью синтетического олигонуклсотида и использования одного из тионуклеотидоа (дарий). х — место мутации-, жирным выделе! Ра нить, содержашая тионуклеотиды !лерг !ас! РВ1песспрг д Ара А ! ДНК-ллгазс !мК !сс! Рис. 8.9. цведенис му!ации в ген !ас7. с помощью полил!еразной цепной реакции. Мутация зашифрована в праймере 2. Праймсры обозначены стрел- ками, мутация — жирной точкой .~,! ьы 1ас! ~ Первый ~р рыуал ПЦР ! а Ф' '~е !ась РВ1псссг!р! ~ \ л 1сс! 262 Часы ь!1. Реыыыы ыыэсеыерыы 1ы пыо Если известно, какую аминокислоту надо заменить„но нс ясно — на какую, применяют метод случайного мути слеза данного кодона (Ксй!1ааг-О!м>п, Бацсг, 1938).
Для зтого синтезируют олигонуклеотид, включаюц1пй мутируемый кодаи. Когда в процессе синтеза очередь доходит до первых двух нуклсотилоа колона, то в реакционную срелу лобавляют все четыре ФХТР, а при подсга~ к1вке третьего нуклсотила в среде присутствует смесь е)ОТР и е!СТР. Эта процедура проводится лля того, чтобы получснньгй препарат олигонуклсотилл содержал в мутирусмом сайте варианты кодонов лля всех 20 аминокислот. Синтсзирук1т также комплсментарную пить, в которой данный колон представлен только останками ипозина (1), потому что он способен образовывать водороднгяе связи с любым из четырех стандартных нуклеотидов. Образовавшимся дуплексом и†-ьы(а~с~— 1! ! — К2 с помощькз предусмотренных для этого сайтов рестрикции К1 и К2 замегцают аналогичный участок гена.
Отметим также возможность направленно изменять последовательностьь ~~уклегпцлов в сайте рестрикции с помощью линкеров или адьцпсров. Так можно вставить в ~сн дополнительные кодоны, сделать новый сайт рестрикции и т. д Сегмеитследифлчестеий ле)елагенез. Этот метол мутагенсза применяетсяя в тех случаях, ко|да ясно, какой сегмент гена слелуст изменить, но не известно, какой нуклеотид конкрезно. Лросгсйший способ такого мутагенсза зак,'почается в выделении искомого сегмента в ниле рестрикта, в обрабо гкс его каким-либо химическим мучагеном и в последующем встраивании в естественное лля него место в гене.
Затем среди клеток, солсржащих рекДНК, ел ыскивают тс, которые приобрели необходимый' фснотип. Этот способ ограничен узким кругом образуюшихся мутаций, он крайне нсзффект ивен и поагому релко применяется. Более продуктивен мутагенез, осуществляемый на олнонитевых ДНК. Искомый сегмент переносят в вектор М13гпр и однои нтевую ДИК реком бинае и ного фага обрабатывают химическими мутя енами. Обычно применяют бисульфнт натрия, который, лсзаминируя дезоксицитидиновые остатки, преврипаст их в уриди- Глава 8. Операции иа еУИК 263 новые. Используют также вещества, молифицирующие основания (гилразин модифицирует пиримидины, муравьиная кислота — пурины, азотистая кислота — аденнн н цитозин).
Далее с использованием стандартного праймера (им может служить также нить какого-либо рсстрикта клонируемого Фрагмента) и ДНК-цолимеразы частично восстанавливается вторая нить (рис. 8.10). При применении бисульфита натрия в синтезируемую нить ДНК вместо дезоксигуанозина подставляется дсзоксиадснозин, что в дальнейшем приведет к транзиции — замене ()С-пар на АТ-пары.
При использовании модификаторов в результате мутирования будут образовыва1ъся тра1 1- зинин и трансвсрзии, поскольку ДНК-полимсраза, встречаясь с модифицироващгым основанием, подставляет случайный нуклеотид. На заключительном зтапс ссгмсьп переклонируют в неповрежденный вектор и результат вьивляют проверкой фенотипа трансформированных клеток.
я Р. Перенос 1 ианБО, в П ~' б, з~' в ,у в М13шр в ДНК-налнмевазв1 ' . Ч Перенос - В., 1~ -~ 1( л Првнмер ( с-) / вгивомнду Я Рис, 8.10. Мутирование сегмента ДНК с помо1лыо бисульфита натрия. а — рекомбннантная плазмвла; б — нгпь ДНК рекомбинантного фага М13гпр; в — та же нить после мутагепсза; г — синтез второй нити рекомбинантнои фаговой ДНК; л — рекомбинаптпая плазмила с мугантной вставкой. Мутирусмый сегмент выделен жирной линией; й — сайт рестрикции; стрелкой указано положение праймсра 264 Часть !1 Генная иняеенерия Ьн ина Этапа персклонирования можно избежать„если в рскДНК удастся создать однонитевой участок в районе искомого сегмента.
Один из способов заключается во введении ника рядом с этим сегментом и в образовании бреши в его сторону с помощью экзонуклсазы Ш. Мутирусмый сегмент ДНК обычно находится в векторной молекуле, поэтому для введения ника можно использовать подходящие сайты рестрикции, имеющиеся в полилинкере. Обработку ДНК рестриктазами всдуг в присутствии бромисгого эгцаия„поскольку при этом рестриктазы вместо расщепления ДН К образуют в ней ники.
![](https://s.studizba.com/z.php?f=/templates/si/i/noavatar.png&w=100&h=100&t=1"){kind=avatar}
