Рыбчин - Основы генетической инженерии - 2002 (947310), страница 53
Текст из файла (страница 53)
сой; ВР6 — фага ВР6; Т? — фага Т7. Стрелки над промоторами указывают на направление тргаюкрипции. Другис обозна сепия см. рис. 7,11 Вектор рАс(Н)ысВП (вариант .-'' васи Ъс вектора рАс)10; см. рис. 7.11) также обладает двумя системами прямой се- ЛЕКЦИИ. ВО-ПЕРВЫХ, бпаГОЛаря Сай- ВЯ Во!! ВРо Ваозп! тт Ноа там !охР рекДНК может быть упакована в головку фага Р1. Вовторых, селективным маркером служит бациллярный ген засВ, находящийся под промотором Е.
сой (рис. 9.2). Пролукт этого гена превращает сахарозу в леван, губительный лля кишечной палочки на средах, солержащих сахарозу. Между промотором и геном встроен полилинкер, в ВаглН1-сайт которого встраивают ХаиЗА-рестрикты геномной ДНК. Процедура клонирования идет по схеме, представленной на рис. 7.11, с тем исключением, что инфипированные реконструированным фагом клетки высевак>тся на срелу, содержащую кроче канамиципа еще и сахарозу как елинствешгый источник углерода. Отметим лве особенности строения полилинкера. Во-первых, он ограничен сайтами лля релкощепящих рестриктаз .9771 и Юог(, позволяющими овырезать" длинные вставки без риска их фрагментации. Во-вторых, по обе стороны от ВатН!-сайта, а значит, и от клонироващюго фрагмента, находятся фагоспецифические промоторы.
Опи лают возможность синтезировать !л игги РНК, комцлементарные копнам вставки, и использовать их как зонлы лля "про~улки'" по хромосоме (см. с. 292). 2?б Часть!1. Генная ннэеенерня >и ино При клонирова>сии генов с использованием космил (см. рис. 7.9) предпочтение отдается также образованию рекДН К с участием рестриктаз Ваа>111 и Юас>ЗЛ. С>н>собы работы с векторами т'ЛС описаны в гл 1! . Здесь же отметим нестабильность получаемых с их помо>цью клонов. Например, в геномной энциююиелии Е яибс>1>я в 10 % клонов были отмечены перестройки (Л2еуес)о ес а!., 1993). Составление и хранение колленяии классов.
Отметим, прежде всего, что в зависилк>сти от размера банк генов может сос пать из инливилуальных клонов или из их смеси. Первое рапионально лля микроорганизмов, копна число клонов банка составляет несколько тысяч. Так был получен первый банк Е со?с' (С!аг)се, Саг(>оп, 19?б), состоящий из фрагментов ДН К в среднем ио 14 т.и.и., клонированных в плазмиле Со! Е1 (строго >оворя, это не банк, а клонотека, его полнота только 80%). Получение банка в виде индивидуальных клонов необходимо, когда ставится залача сс>ставления геномной энциклопедии. В таких случаях число отбираемых клонов должно превышать указанные в табл.
9.! числа в 7 — 10 раз, чтобы обеспечить необходимую точность при их физическом картировании. Энциклоиелией является геиомная библиотека Е. сой (Ко!>ага ес а(., 1987), составленная в результате анализа 3400 клонов, которые были получены с помощью векторов ).ЕМВЬ$ и 7,200! (вектор ?.ЕМ В!.4 отличается от 7 ЕМ ВЕЗ обратным расиоложениемиолилинкеров, см. рис. 7.8). Полный банк предсгавлеи всего 47б к юнами, храншиимися в международных и национальных коллекциях, в том числе в России (ГНИИГенетика, Москва). Ои и сейчас применяется лля поиска и изучения генов Е.
со(й С помощью вектора рЛс)10яасВП получена сеномная энциклопедия патогенного лля человека микроба Рлеи>носувги гаг(л?с (Месс)>еуа ес а!., 199б), размер >енома которого 10000 т.и.н. Коллекция сосгоит из 4800 индивидуальных клонов. Лвторы отмечают стабильность своей библиотеки.
Наиболее стабильно и длительно хранятся банки, полученные с иомошьк> ?.-векгоров. Реконструированные гв нйго рекомбинантные фаги быстро инактивируются, поэтс>лсу их немедленно рассевают с плотностью около 100 негативных ксюоний на ! кв. см (5-10 тысяч иа чашку Петри). Чашки инкубируют 8 — !О часов ири 37 "С, не Глава 9. Лнализ генов и гсномоо 277 позволяя образующимся нювтивным колониям перекрывагься. Далее фаги экстраг ируют буфером и после ~ !ентрифуги рован и я хранят пол хлороформом при 4 "С многие годы. По-вилимому.
"вечен" способ хранения фагового банка при -70'-'С в '*мягком" агаре в 30%-ном глицерине (Кйпшап, Со!1еп, !987). Амплификация банка необходима для хранения библиотеки или ~ювторного скринини. Однако при повторных пересевах прелставител ьпосгь банка ухулшается из-за различий в скоросгях размножения клонов, что обусловлено особенносгями нх нуклеотидных последовательностей и разницей в длине вставки.
Поэтому некоторые исследователи прелпочитактг кажлый раз получатзыгеномную библиотеку в фагах заново. Коллекция бактериальных кюнов, солержащих рекомбинантные космилы, получается схсщным образом. Выросшие на селективных чашках микроколонии (20 — 30 тысяч ца чашку) объелипяют и хранятв среле с глицерином прн — 70 "С, распределив прелварительно в ~несколько лесятков пробирок. Кажлая пробирка используется после оттаивания единожды лля скрининга или лля лругих про~ !едур.
Конечно„и в этом случае возможен немелленный скрипни г банка без его амплификации, лля чего и~ ~фи~ щрованные бакзерии высевают сразу на гибрилизационные фильтры (см. с. 2()0). Банк кДИА. кД1 !К играют важную роль в исследованиях по молекулярной биологии эукариот. Они прелставляютсобой гены без цитронов, необходимые лая эка~рессии эукариотических генов в бактериях, а также для получения информации о колирующей часги гена (напомним, что кДНК пе содержит регуляторных элементов генов). Анализ кДНК применяют лля изучения клеток„по какой- либо причине меняющих активность своих генов.
Зачастук~ кДНК служат также зонлами. Например, если в геномном банке нужно ~ гаити мепщом гибридизации клон с заданным геном, а с~ ~ецифическая мРНК прелсгавлена в малом количестве, то с~ гачала синтезируют кДН К, клон ируют се, метят и используют лга скривии га. Выделение и очисгка ломинируюшей ы!'1! К из высокоспепиализированных клеток являктгся относительно простой залачей, что позволяет сразу синтезировать инливилуальную кДНК. Такие кДНК можно клопировать в векторах типа М ! Зшр и при необходимости сразу их секвепировать. кДНК лля редко встречающихся мРНК можно получить только скринингом банка кДНК. 278 Часть !!. !синая инженерия ен гнго рнк ат 5' Гнлрозпз мРНК З' зь зн,з' а) ,~,рнк з н 3' Йтп 5 Коппснал транс4ераза отп 5 зас, ДНК-полннараза 1 ДНК-ннзаза 5'до ' ДНК-поламсраза ! 5зЮп аАп 3 3'асп атп 5' ~р, з' ат Рис.
9.3. Схемы синтеза второй нити кДНК методом пик-транс- ляции (и) и праймировапнем с помонзью олигопуклеотида (б) Банком кДНК называют коллекцию ДНК-копий мРНК юзезок конкретной ткани на определенной стадии развития организма. Типи зная клетка млекопитающих содержит от 10 до 30 тысяч разных мРНК со средним размером 1,5 — 2 тысячи нуклеотидов, треть из которых представлена низким числом копий (менее ! 0— 15 на клетку). Именно эти редкие мРНК определяют, какое число клонов кДНК необходимо отобрать, чтобы банк был представизельнынь Для вероятности 99 % это число близко к 200000. Успех синтеза полноразмерных кДНК зависит от качества выделенной суммарной мРНК.
Классический метод образования второй нити КДНК с применением нуклеазы $1 (см. рис. 6.1) заменен более эффективными. В одном из них в дуплексе мРНК: кДНК с помощью РНКазы Н вносятся ники и бреши в пить РНК (рис. 9.3,а). Образовавшиеся Фрагменты мРНК служат праймерами для реакции ник-трансляции, в результате которой ДНК-полимераза ! почти полностью заменяет РНК на ДНК (О(гауапза, Вега, ! 982).
Не заменяются лишь несколько нуклеотидов на 5'-конце мРНК. Если информация об этих нуклеотидах важна„то синтез второй нити кДНК праймируют с помощью олигонуклеотида (дСз) е для че! о предварительно после гидролиза мРНК на 3'-конце первой нити кДНК нарви!ивают короткую цепочку поли(с(С) (рис. 9.3, б; ).апс1 е! а!., 1981). Глава 9. Ляилаз генов и геяочоо 279 Небольшой размер кДНК позволяет вести ее клонирование в плазмидных векторах, однако для полу чения банков предпочитают использовать Л векторы, что облегчает хранение рекДНК.
Наиболес улобны векторы Лйт)1, ЛОКЕ8 и ЛИАР (см. рис. 7 7), так как они присгюсоблены для экспрессии клонированных кДНК. Синтезированные даун иге вые кДН К обрабатываются Д1-! К-полимеразами с целью образования у них ровных копцов. Затем их пнкубируют в присугствии ДНК-лигазы фага Т4 и большого молярного избытка (в 100 раз) подходяп!их линкеров, обрабатывают соответствующей рестриктазой и, очистив от линкеров, лигируют по липким концам с вектором.
Для прелотвращения олигомеризации кДНК в процессе лигирования необходим высокий молярный избьпок векторных молекул по отношению к кДНК. Нри этом повышается вероятность объелинеция плеч вектора, поэтому их концы до лигирования приходится дефосфорилировать. Для образования липких концов цри создании банка кДНК следуег предпочесть редкошепящие рестриктазы, так как велика вероятность того, что многие молекулы кДНК булуг содержать сайты рестрикции для обычных рестриктаз. Коне пю„возможно провеление их предварительной молификтции с помощью одноименных сайт-специфических метилаз. В качестве альтернативы используют адаптеры вместо линкеров.
В этом случае отпадает необхолимость обрабатывать кДНК рестриктазой. Можно даже избежать процедуры присоединения линкера/адаптера к кДНК, добавив последовательности, кодирующие сайты ресгрикции, в 5'- концы праймеров олиго(с$Т) и олиго(г%) при их синтезе. Если эти сайты разные, то появляется возможность направленной всгройкн кДНК в век гор, что особенно важно для их экспрессии. Созлан вектор, позволяющий без переклопирования: 1) полу)ать банки полноразмер~~ых кДНК, 2) опрелелять их нуклеотилную последовательность и 3) транслировать каждук> кД1!К !л пгго или 1п иго (Каго еГ а!., 1994). Скринииг банка генов Существует несколько методов скрининга, т.
е. поиска в геномной библиотеке или в банке кДНК тех клонов (бактериальных или граговых), которые содержат рекДНК с заданным геном. 230 Часть 11. Генная ия;исеяерия ~п Ына Из них основные — гибридизационный, иммунологический, генетический и рекомбинационныи. Выбор метода во многом зависит от использованной системы клонирования. В случае клонирования эукариотической ДНК в клетках Е. сей единственным *'паспортом" чужДНК служит ее нуклеотидцая последовательность.
![](https://s.studizba.com/z.php?f=/templates/si/i/noavatar.png&w=100&h=100&t=1"){kind=avatar}
