Рыбчин - Основы генетической инженерии - 2002 (947310), страница 57
Текст из файла (страница 57)
Ио этой причине они малопригодны для генетического анализа, поскольку, по крайней мере, половина всех особей гомоюглельны по такому маркеру. Более информативен полиморфизм маркеров, вызванный существованием тандемпо повторяющихся участков в некодирующих областях ДНК эукариот. Например, в геноме человека ОС-богатые участки длиной 10--40 пар цуклео.пщов л>о>ут повторяться до т ысячи раз в данном локусе, образуя так называемый минисателлит.
Длинные гомологичные у >ветки, сост>япцие из повторов, подвержены рекомбинации, происходящей, как правило, вследствие неравного обмена при мсйозе или митозе или вследствие ошибок при репликации Д11К. Поэтому минисателлиты в определенных локусах у разных неродственных особей отличая>тся по числу повторов, т. е. опи полиморфны. Подбором полходяших рестриктаз, которые расщепляют ДНК по обе стороны минисателлита, но не вну >ри него, различия в числе повторов могут быть выявлены как разница в длине рестриктов.
Миписателлиты существуют в виде разбросанных по всему геному семейств, родство членов которых определяется гомологией с некоторой базовой последовательностью. Клонировапные участки минисателлитов используют для приготовления зондов, с помощью которых при гибридизации в мягких условиях выявляют в геномной ДНК их множественные аллели. Олин зонл с помощью бло гиш а по Саузерну позволяет наблюдать одновременно за наслелованием нескольких десятков миписателлитов, расположенных в разных локусах, по относящихся к одному семейству.
Минисателлиты достаточно коротки, вследствие чего их длина в данном локусе относителыю стабильна в ряду нескольких поколений. Поэтому опи могут служить маркерами и позволяя>т проводить се>регационны й анализ и. кроме того, облегчают картировапие сцепленных с ними >енов. Метод ЛДРФ особенно удобен как экспрессный способ вь>явления генетических дефектов у людей (см. гл.
! 5). На основании данных по частотвм рекомбинации в процессе мейоза (оогенез или сперматогенез) подсчитано, что в геноме человека достаточно найти и картировать около 1000 полиморфных маркеров, чтобы уста- Глава 9. Акееиз геков и гекомее 297 новить надежную сцепленность любого гена с каким-либо полиморфцым участком ДНК.
Картированис генов с опорой на метод ПДРФ осуществляется с разрешением 10" — 1О' п.н. Дтя работы по физическому картированию хромосом и бактериальных геномов применяют редкощепящие рестриктазы, а их рестрикты анализируют гель-электрофорезом в пульсирующем (РРИ~Е) или инверсионном (Р!С Е) электрическом поле (см.
приложение). Рестрнктазы Ачя! и .зд1, сайты узнавания которых содержат 3 п.н., широко используются для этих целей. Среднии размер фрагментов, образуемых ими, составляет для ДНК Е. со!! 200 и 150 з.п.н., соответственно, а для ДНК человека 100 и ЗО т п.н. Рестриктаза Лги! (ТСОСОЛ) и ВееН!! (ОСССОС) узнают сайты из 6 п.н., в состав которых вхозьчт динуклеотиды СС', редко встречающиеся в ДНК млекопитающих.
Поэтому их используют для расщепления этой ДНК. Применяют также комбинированное воздействие на ДНК оцрелеленных метилаз и рестриктаз. Например, рестриктаза Ври!расщепляет только метилированный сайт СТАТС. Аденин мокн ут метилировать в обеих нитях метилазы Тат!1 (ТСОА) и С!а1 (АТСИЛТ). Поэтому после их действия рестриктаза 7)рп1 узнает только "восьмерку" ТСОАТСОА или "десятку" ЛТСОАТСОАТ. Очевидно будет использоваться и недавно открьпая рестриктаза ЮдгА1, также узнающая "десятку" САСССООТССк Физические карты отдельных хромосом строят последовательными операциями: 1) конструирукп банк генов данной хромосомы путем расщепления ее ДНК редкощепящими рестриктазами и клонирования фрагментов с помощью векторов типа гАС, ВЛС или РАС (см.
гл. 7); 2) выявляют какие-либо характерные свойства каждого фрагмента ДНК, например, ПДРФ, профиль гибрилизационных проб ит. пб 3) получают клонотеки каждого фрагмента ДН К путем клонирования в е.-векторах субфрагментов, образованных частичным его гидролизом мелкощепящими рестриктазами; 4) расставляют субфрагменты в определенном порядке, используя правило, что если два клона имеют некоторые общие характеристики, то они перекрываются; 298 '1асгь 11. Уеллая илжеаграл л~ ваш 5) устанавливаюг порядкок исходных (крупноразмерных) фрагментов.
Проанализируем пункты 4 и 5 этой программы. Размер субфрагментов таков, что пункт 4 можно выполнить методом "прогулки по хромосоме." (см. рис. 9.9). В то же время лля расстояний, превышаюпшх несколько сотен пар нуклеотидов, этот метод слишком трудоемок и, кроме того, по мере увеличения зшины повьппается вероятзюсть ошибки в картировании из-за повторов и других причин. Поэтому с целью картирования фрагментов ДНК, образуемых редкошепящими рсстриктазами (пункт 5 программы), разработан метод "прыжков по хромосоме" (Со)(шз, %е1зяпап, 1984). Этот метод фактически является вариантом метода "прогулки по хромосоме".
Для его осуществления с использованием 2,-векторов конструируют дополнительно "прыжковую" библиотеку (рис. 9.12,а) и библиотеку клонов-связок (рис. 9.12,б). В первой библиотеке каждый из крупноразмерпых рестриктов (в нашем примере Жог() прелставлеп клоном, в котором сохранились только его концевые части (. и В, разделенные маркером зирГ. Такие клопы суптсственно облегчают процедуру картирования, поскольку позволяют заменять большие фрагменты их малоразмерными копиями. Второй банк содержит клопированные из геномпой ДНК сайты узнавания для редкошепягцей рестриктазы (Фш() с примыкаюп~ими к ним участками ДНК„так что каждый из клонов этого банка представляет собой связку между соседними (и и и+1) крупноразмерными фра~ ментами гецомной библиотеки.
При конструировании обеих библиотек для селекции применяют ген кирЕ, который присоединяют к рестриктам геномной ДНК, а в векторе предусматривают наличие ашЬег-мутаций. В несупрессирующих клетках Е. сод хир" развиваются только рекомбинантныс фаги, приобретшие ген гирЕ. Используя клон- связку как гибридизационный зоил в геномной или *'прыжковои*' библиотеке, отыскивают очередной клоп.
Методы "прогулки" и "прыжков по хромосоме" применяют и лля частных задач, например, для картирования изучаемого гена (фрагмента ДНК) относительно сайта (фрш мента ДНК) с известной локализацией. Глава 9 Ангссоз генов и гглолюв 299 а) ге вл Лнк иов нов нв а) !Сс МЬор, аасснчное реасаелланае ьвю! М!ю! ьяля Мю! двх-лнгвса ва я! в и! О О мр! "р мы есрр мьс! „мь ! а и ! сарр ! ае! + Квсанрсаюаю в 3ЛАр Осбср в юре юнслал иав нса Кноннравевне в ХСЬ4А '1!< г а нов нов Рис.
9.12. Схема конструирования апрыжковой" библиотеки (а) и библиотеки клонов-связок (е) лля физического каргирова- ния ДНК методом "прыжков по хромосоме". 1. и Гс — левый и правыи концы Фас!)-рестрикта; и и и+1 - - соселние участки в хромосоме, разделенные святом Фа!1. Интересный подход был использован лля составления физической карты Е со!!' (КоЬага е! а1., 1987). Были определены рестрнкционные карты клонировапных фрагментов ДИК из гепомной библиотеки и установлена с помощью компьютеров их очередность путем выявления сходства в корщевых участках этих карт. Здесь было возможно появление ошибок из-за повторяющихся последовательностей, С целью преодоления этого препятствия для 1()5б клонов методом частичного перевара (см.
рис. 9. 8) были построены 300 Чзсзь 11. Уенлал иижслгрил гл ива карты для восьми рестриктаз. Гак удалось точно паспортизировать проанализированные клоны и цо совпадению отдельных участков объединить их в 70 контигов, т. е. ~руин сцепленных и расположенных в известном порядке клонов. Закрытие разрывов между контигами велось направленным поиском недостающих клонов с помощью гибркдизацишшых тестов и проверки их рестрикционным каргированием. Хотя для этого припщось дополнительно проанализировать 2344 клона, семь разрывов закрыл ь не удалось.
Образовавшиеся семь суперконтигов были привязаны к генетической карте Е со(Л Составление полной энциклопедии было вскоре завершено вылелением перекрывающихся космидных клонов (Клон ег а!., 1989). Определение первичной структуры ДНК В середине семидесятых голов были прелложепы лва метода определения нук чеотилной последовательности (секвенирования) небольших фрагментов ДН К вЂ” химической модификации оснований (метод Максама-Гилберта; Махагп, Ойбег1, 1977) и полимеразного копирования (метод Сэнгера; Яапвег, Соц)хоп,)975; Вапйег ег а!., 1977).
Первый метод основан на химических реакциях, ведущихся непосредственно на анализируемой ДНК. Во втором методе информация о послеловатслыюстях нуклеотидов черпается из анализа одноцитевых копий анализируемой ДНК. Обоим методам присущи некоторые общие черты. 1. Секвенирование вслуг с очищенной (как правило, клонированной) ДНК. 2. В одной реакции секвецируется только одна нить ДНК. 3.
Реакции велут, как минимум, в четырех разных пробирках, причем отсчет нуклсотидов во всех пробирках ведут от олинакового начала. 4. В результатс реакции в каждой пробирке образуется набор меченых однонитевых фрагмегггов ДНК различной длины, причем число вариантов длин равно количеству опрелеле нных (в каждой пробирке разных) нуклеотидов в анализируемой ДНК.
5. Разделение фрагментов ДН К по их длинам велут методом электрофореза в 6 — 20 %-ном полиакриламилном геле (см. прило- Глава 9. Лпалпз гевов и гевомов 301 жение) вде~гатурируюшихусловиях (7 М мочевина„70 "С), чтосводит к минимуму влияние вторичной структуры фрагментов на их гюдвижность. Электрофорез проводят одновременно на параллельных дорожках в одном и том же геле, что позволяет различать до 300 фрагментов, отличающихся друг от друга на один нуклеотид.
![](https://s.studizba.com/z.php?f=/templates/si/i/noavatar.png&w=100&h=100&t=1"){kind=avatar}
