Рыбчин - Основы генетической инженерии - 2002 (947310), страница 54
Текст из файла (страница 54)
Этот "пасгюрт" присутствует при всех способах клонирования, гюэтому общий метод скрининга — гибридизация рекДНК с зондами, т. е. с нуклеотидными последовательностями (олигонуклеотидами, одцонитевыми кДНК или мРНК), которые комплементарны отыскиваемому гену. На практике для этого пользуются методом гибридизации колоний (Оп1пз1еш, Нояпеаз, 1975). Если клонируемые гены экспрессируются (некоторые банки кДНК; клоцированныс в Е свй геномные банки клеток кишечной группы, их фатов и гшагмил), то лля скрининга применяют иммунологические и другие методы, регистрирующие присутствие специфического белка. лтеиюод еи6ридизайии колоний. Метод заклю кается в следующем (рис.
9.4). На чашки Петри с плотной средой ноыец~ают стерильнгле нитроцеллюлозцые фильтры и стандартным способом наги)сят на них бактериальные клетки, содержащие рекДНК. Питательная среда своболно лиффундирует через фильтр, и на нем образуются колонии клеток. С них делают перепечатки на чашки с аналогичной средой и таким образом получают "справочную" библиотеку клонов, из которой берут затем клетки с искомыми рекДНК. Далее фильтры с чашек переносят на листы ватмана, смоченные в 0,5 н )яаОН„где клетки лнзируются, а освободившаяся ДНК денатурируется.
После этого фильтры обрабатывают цротепназой К для удаления белков, выдерживают при 30 С для фиксации ДНК на фильтрах, затем промывают последовательно буферным раствором (р11 7„б) и хлороформом. Далее их сушгт и приступают к самой процедуре гибридизации. Для эпгго фильтры смачивают в цитратном буфере, содержагцел1 50 % формамида и меченный радиоактивным фосфором зонд, и выдерживают 15— 20 ч при 42 С под слоем масла После отмывки формамида и радиоактивности нейтральным буфером остяки нсгибридизовавшегося зонда гилролизуют нуклеазой В!. Далее фильтры вновь промывают, подсушивают и авторадио~ рафиру1от на рентгеновских пленках при — 70 'С.
Проявленные рен1теновские пленки совмеша- Глава 9, Анализ генов и генолтоо 2о! ют с конт)ьольными чашками ььз "справо ьной" библиотеки кло- нов. Пятна на пленках позволяьот выявить на чашках те колонии, которые содержат рекДН К. Отметим, что все большее распростра- нение получают и нерадиоактивныс метки.
Чашка Петри Чакан Петри с выросшими на фильтре с "библиотекой" колоннами клоиоа о с 0 ' ) Перепечатка А й ~ Клоне Лиане бактерий, ( рекомбинантной лснапрацнк ДНК / !гнк , Ь йкторалиочтафнк и ,/ Фильтр Проньтетптач ренттеноаскал пленка Рис. 9.4. Поиск клонов с рскомбннантными молскуламн ЛНК методом гнбрилиьацин колоний Данный метод используется также для поиска определенных клонов среди фаговых негативных колоний (до 50 тысяч на одной чашке Петри). Однако в отдельной негативной колонии недостаточно фаговой ДНК для ее проявления при авторадиографии.
Г!оэтому в данном случае вначале проводят амплификацию фагов: стерильные нитроцеллюлозные фильтры смачнвакьт в суспензии индикаторных бактерий, содержащей около !О" клеток в ! мл, подсушивают на листе ватмана, наносят на чашки с негативными фаговыми колониями и помеьпают в холодильник. После 30 мин выдержки, позволякьщей фагам диффундировать в фильтры, их переносят на свежие чашки с питательной средой и инкубируют в 232 Часть И. Геаьд>я ан>келелиа д> М<г» течение 12 ч при 37 "С. За это время па гюверхности фильтров образуется газон индикаторных бактерий с копиями негативных колоний, содержащими повьппенное число фагов. Далее описаннымм ранее способом осуществляют гибридизацик> колоний, слегка варьируя условия опыта.
Благодаря амплификации фагов прел>я авторадиографии зпачителыю сокращается (до нескольких часов). С олной чашки можно сделать несколько перепечаток филырами, что позволяет проводить параллельные опыты с тем же или другими зондами. "Справочной" библиотекой клонов служат чашки с первичными негативными колониями. В качестве зондов для гибридизации колоний, как правило, используют синтетические олигонуклеотиды опрелеленной Лли~п«.
Длина таких зо>оюв зависит от размера анализируемого генома. Согласно вероятностным расчетам, лля поиска бактериалы<ых или дрожжевых генов в геномпых библиотеках достаточно 15-членного олигонуклеотида, а для поиска генов животных или растений — 1<>-члепного. Это те минимальные размеры последовательностей, которые встречаются в названных гепомах только один раз.
11а практике используют олигонуклеотидпые зонды, солержащие не менее 20 нуклеозилных остатков. Конечно, их синтез возможен, если извест>ю строение гена или, как минимум, соогветсгауюшеы> белка либо его части. Но из-за вырожденности кода восстановить алекватпую нуклеотидную послелователыюсть по аминокислотной последовательности нельзя. 1)оэтому для синтеза зонда выбира>от такую часть гена, в которой преимуществсгпю находятся кодоны уникальных (Ме1, Тгр) или «безопасных» (Лап, Лзр, Суть Н)з, РЛе, Туг, С>!у, ()1ц, 1 уз) аминокислот. В последнем сх<учае ошибки в выборе колонов приводят только к замене пурина на пурин или пиримидина на пиримилин. Это наименьшим образом дестабилизирует дуплекс зоил-ген в процессе гибридизации. Тем не менее, для компенсации ослабления водородных связей в дуги<скос длину таких олигонуклеотидных зондов увеличивают.
Другой выход заключаешься в синтезе набора зондов стгп<лартной длины, в котором представлены все возможные варианты строения зонда. С целью скрининга используют комбинацию всех вариантов. Глава 9. Анализ генов и геломов 283 Ясно, конечно, что зонды могут гибридизоваться не только с целым генолк но и с его частью. Поэтому положительный результат скрининга методом гибридизации не означает, что во всех выявлещ ~ых колониях содержится целый ген. Возможен направленный поиск в банке кДНК только тех генов, которые участвуют в определенном процессе, например, индуцируются действием какого-либо гормона. В этом методе, носящем название вычитательная гибридизация, сначала синтезируют первые нити кДНК суммарной мРНК, выделенной из индуцированных клеток. Затем образовавшуюся однонитевую кДНК гибридизуют с суммарной мРНК, выделенной из неиндуцированных клеток. Сформировавшиеся дуплексы мРНК:кДНК удаляю~, а негибридизовавшиеся кДНК использу>от для синтеза лвунитевых кДН К, которые и являются целью поиска (см.
обзор Свердлов, ! 993). Иммунологические мегподы. Зти методы применяют для вь>явления определенных клонов с рекДНК, если клонируемые гены экспрессируются. Напомним, что молекулы белков имеют по несколько антигенных детерминант (эпитогюв), на каждый из которых в организме животных вырабатывается свое антитело (специфический иммунопюбулин). Сыворотки, получаемые стандартными метолами, поликлональны, т. е. содержат антитела ко многим эпитопам данного белка. Возможно получение и моноклональных антител, если использовать гибриломы (см. рис. 5.8).
Хотя моноклональные антитела при скрининге дают неболыпой фон ошибочных положительных ответов, используют обычно поликлональные анти> ела. Зто связано с тем, по детектируемый белок может иметь в чемто измененную струкгуру или г>рисутствовагь в виле фрагмента. Для ш>иска нужного клона среди небольшою числа колоний примсняютметод прямой иммуноселекции. Онпредельно прост.
На чашки с питательной средой, в которую добавлены антитела к летектируемому белку, высевают клетки, содержащие рекДНК. После образования колоний клетки лизируют и подвергают инкубации. В результате вокруг колоний, содержащих определяемый белок, появляются кольца иммунопреципитации.
Лизис клеток осуществляют с помощьк> фага или лизоцима. В первом случае клетки вначале лизогенизируют фагом ),с1857 и выращивают при- 284 Час гь И Ге»»а» и»же»ер»» ьл и<го 30 "С. Затем вызываю г их лизис ш<лукцией профа<в при 42 'С. Во втором случае клетки в колониях инактивируют парами хлороформа и заливают «мягким» агаром, солержащим ЭДТА и лизопим. М стол рапи о им мунодетекции, в которол< метка "'1 вволится в белки гу> г<ггв, гюзв<игяет вьщвлять нужные клоны среди 10— 20 гысяч колоний на одной ч<ппке Петри.
Ранее он основывался на применении полпвиниловыхлисков, с которыми иммуноглобулины прочно связыва>отея (Вг<юп<е, С><1(>е>т, ! 978). В современных методах рааиоиммунолетекция осуществляется на нитроцеллюлозных фильтрах (11апа)>ап, Мезе!воп, 1980). Удобно проволить скрининг банков, получен> <ых с помощью экс> <рессирукх них веки>ров типа ),ьч11 ( >'оцп8, Оа>зз, 1983).
Эго лелает возможным анализировать непосредственно фаги (что более эффек>ивю) или лнзогенные бактерии. Напомним, что в векторе ),в<1 ! (см. рис. 7.7) чужДНК вставляется в «ачало гена !ас7., поэтому рекомбинацп<ый фаг си< п езирует гибрилный ("слитыи") белок, находящийся под контролем 1 ас-репрессора. 0>аги из банка генов расссвак>т с пло>пюстью 20 тысяч на чашку на клетки Е. с<>1> У!0907>з<И, солержащие плазми чу рМС9, когорая кодируе< ьлс-репрессор (рис.
95,а). Репрессор предотвращаег прежлевременную экспрессию клонирован><ого ге«а, оберегая тем самым инфицирова«ные клетки от потенциально токсичных пролуктов. Чашки инкубируют 3-4 часа при 42 "С до образов<и<ил фаговых микроколоний, после чего их покрывают нитроцеллюлозными фгв<ьтрами, смоченными в растворе изопрогпил-(3-!3-тиогалактозила (1РТС>, инлуктор !ас-оперона), и дополнительно инкубирук>т 4 часа при 37 "С. Зга процедура сгл>собствует выходу белков из лпзируемых бактерий и связыванию их с филь~рами. Далее фильтры снимают с чашек, промывают специальными буферами и вьщерживак>т 2--4 часа в буфере со специфическими иммуноглобулинами.
11ри этом со<ыветствук>щие антигены связываются с антителами. Наконец, фильтры отмывают от несвязащпихся антител. Положение комплексов антиген-антитело на фильтрах и„следовательно, координаты колоний, синтезирующих специфический продукт, опрелеляюг авп>- радиографически <л>еле обработки фильтров мечеными иодом-125 "вторичными" анппелами с тои же специфичностью или меченым белком А Яа7><>у!ос<>ссиз аи>.еиз, который способен связываться с константными областями иммуноглобулинов. Проявившиеся на ав- торадиограмме пятна соотносят с гголоткением колоний на сохра- нившейся исходной чашке.
| Наложение фильтра с 1РТС Перенос колоний фильтром на чашку с 1РТСг <; сс14:, ~ после 4ч при 42'С о 1 1Г промывка и вьгдс1вкьп в растворе ипвтел Поконевие кшапшксов англген-антнтело на фгстьттс Дсбаптенве ' -1БО влн белка 1-А Б.ашепа ; и авгораннографик Сравнение авторппиограниы с исходной чашкой и / отбор юшанвй Белки в НК на фишарс Рис 9.5.
![](https://s.studizba.com/z.php?f=/templates/si/i/noavatar.png&w=100&h=100&t=1"){kind=avatar}
