Рыбчин - Основы генетической инженерии - 2002 (947310), страница 55
Текст из файла (страница 55)
Ралиоиммунодетекция рекомбинаитнык клонов вектора ХБ111 из фагового га) и бактериального (6) банков, НК вЂ” негативные колонии и) Банк генов в ьат11 Рассек У м .Ронк после 4 ч еФ кит «1 при42'С Глава 9. Лнализ генов и генолгое 285 б) Банк генов в е. сог11хвтг 1) Рассел Ф , а ° ',, Мироаплопвн е 286 Часть !!. Генная нняеенея»я гл иле Г!роцедура скрини~га банка генов, представленного в виде клеток, лизогенизованных рекомбинантными фагами, сходна с вышеописанной. Клетки из банка >е> юв рассева>от с г>лотностью 20 тысяч на чашку и чашки инкубируют при 30'С до образования микроколоний !рис. 9.5„0).
Колонии перепечатывают на нитроцеллюлозные фильтры, а фильтры поме>дают на свежие чашки, содержал>ие 1РТО, и дополнительно их инкубирук>т 2--4 >аса при 42 'С. Затем клетки обрабатывак>г парами хлороформа, что вызывает лизис клеток и выход белков. Дальнейшие этапы скрининга полностью аналогичны описанным ранее Отметим, что для летекции антител разработаны также и нсрадноактивные (кроме>генпые) методы. Они основаны на свойствах пероксидазы из хрена и шелочной фосфатазы образовывать цветные нерастворил>ь>е продукты в процессе ферме»тативно!!> реакции. »и ферменты ковалентио связывают с "вторич ными" ант ителами, которые реагируют со спе> >ифическими сайтами на первичных антителах.
! !осле обрабо>ки фильтров такими комплексами в местахлокализацнн искомых белков образук>тся суцеркомплексы антиген — антитело:анти>ело — фермент. Их положение определяют., смочив фильтр в растворе цроявляюшего вещества (субстрата фермента). Например, для нероксилазы хрена хромогенны м субстратол> являетея 4-хлоро-1- нас)>тол, способствующий появлению на филь грах пурпурных пятен. В качестве ал ьгернативнш о метола "вторичные" антитела связыва>от с биотином, а пероксидазу хрена — с авидином.
Генетическкч! мел>е>д возможен, когЛа клонируемый ген с собственным промотором взят от организма, родственного рецициснтным клеткам„и гюэтому ожидается его экспрессия. В таком слу ие, если ген селективен и его признак носит доминантный характер, то соотвествующие клоны отбирают непосредствешю в селективных условиях. Так, при к>юнировании в плазмиде рВВ322 гена сг>г, ответственного за фаговую конверсию, вызываемую фенами ф80 и !ч15, нужные клоны отбирали как клетки, устойчивые к фату Т1, поскольку ген еог цридаст им такой фенотип. Если клонируемые гены участву>от в клеточном метаболизме, то рсци пиентные клетки должны быть дефектными по соответствук>шему гену, и отбор клонов осуществляк>т гк> эффекту генетической комплементации. 1 лава 9.
Анализ геков и геномон 287 Рекомбинационньтйметодоснован на использовании гомологической рекомбинации в Е. еой между зондом, интегрированным в гпазмиду, и рекомбинантным фатом (Яеес1, 1983). Тестирующая последовательность (гомологичная отыскиваемой) длиной не менее б() п.н. предварительно внедряется в вектор пЧХ (902 п.н.), который содержит полилинкер и ген-супрессор зирг. Геномная библиотека, подвергаемая скринингу этим методом, должна быть сконструирована на базе А-векторов, имеющих супрессор-чувствительные мущции. К таким векторам относятся, например, АС)т4А и 7 ЕМВ1.3А, содержапгие амбер-мутации в генах Л и В (см.
рис. 7.7). Фаги, составляющие библиотеку„сначала пассируют на клетках Е. со1г Кос ', трансформированных рекомбинантной плазмидой пЧХ, где с большой вероятностью плазмида интегрируется в фаговые геномы, имек~щие подходящие гомологичные участки (рис. 9.б). После этой процедуры фаги рассевают на клетках Е. сой лцрс, в которых развиваются только те из них, которые приобрели ген зим и, соответсп~енно, содержат отыскиваемый ген.
Аам Вмп Банк генов в ХЕМВГЗА Е. сов тес+ ':ак Аап Вап апРЕ с Фага не развнаанггся Фагн ратввваннся Рис. 9.6. Схема рскомбинационпого метода скрипника банка генов, сконструированного на базе вектора А11МИ ЗА. Жирной линней выделена отыскиваслгая последовательность 288 Часть 11. Генная инженерня н~ тго Подчеркнем и закдпочспие, что описанные методы скрининга — это лишь способ поиска клонов, которьн могут содержать целый ген и в которых возможен синтез интактных белков. Судить о целостности клонпруемого гена и синтезирусмого белка можно только после лополнительно~ о анализа (как правило, после секвенирования). Физическое картироваиие ДНК еьн-5 -тбсблбблсб гтбт-3 3 -бО'гббтбблАси ббл-5 Он 5 -АССГ1' — — — А-3 3 - Л вЂ” ГСбя-5 Физи ~сской картой молекулы ДНК называют взаимцос расположение на ней сайтов рестрикции для различных рестрикпп с известными расстояниями между ними или, что то же, установленный порядок клонированных фрагментов.
Физически карти- ровать какай-либо ген или какой-либо фрагмент на молекуле ДНК означает определить его положение на этой молекуле в физических единицах, измеряемых обычно числом пар нуклсотидов. Точнейший способ составления физической карты любой ДНК вЂ” ее полное секвенирова~ ~не. У линейной молекулы ДНК отсчет ведут от одцо1 о из ее копцов, а у кольцевых молекул — от какого-либо улобно1 о единичного сайта рестрикции. Традицио1 ~ный способ анализа рестриктов гель-элсктрофорезом описан в приложении. Расположение зон, зафиксированное на фотографии или авторадиограммс, для анализируемой молекулы ДНК является своеобразным паспортом. С введением в практику флуоресцентных меток регистрацию результатов гель-элсктрофореза удалось автоматизировать (Сагуапо е1 а!., 19()9).
Хотя введение такой метки — достаточно трудоемкий процесс, метол оправдывает себя при необходимости проводить массовую "'паспортизацию" фра~ ментов ДНК. Метку (Фл) присосдиняюг ковале~гпю к 5'-концу какого-либо стандартного праймсра и "отжигают" его с комплементарным олигонуклсотидом, 5'ОН-конец которого является липким для используемой в эксперименте рестриктазы (в нашем примере Нжс(П). К образовашпимся меченым луплсксам добавляют рестрикты (выделены жирным шрифтом) Глава 9, Алализ голов л гололзов 289 и их лигируют. Дуплексы присоединяются к обоим концам рест- риктов, причем в каждой нити содержится по олному нику: уФл он~ уон 5 -ТСССЛООЛСОТТОТАОСТà — — АЛОС !ЛСААСббЛСТбб-3 3 -Сб ГССТбСААСАТСОАА ТТСОАТбттбССТОЛСССТ-5 ОН/ зОН ТФ В реальном эксперименте "отжиг", гидролиз анализируемой ДНК и лигировапие велут олновременно в одной пробирке. Далее меченые рестрикты ленатурируют: Фл-5'-ТСССЛббЛСОТТОТАОСГà — — -Л-3'+ + 3'-Л ТТС6АТОТТОССТСЗАСССТ-5'-Фл н разделяют гель-электрофорезом в денатурирующих условиях.
Ре~ истрирующее устройство находится в определенном месте и фиксирует зоны по мере их прохождения. На одной дорожке можно разлелять ресгрикты, образованные разными рестриктазами, если их метят различными красителями. С помощью этого метода постигается высокая точность опрелелепия размеров ресзриктов, потому что все они (включая реперные) идут по одной дорожке и проходятло регистрации одинаковые расстояния. Данные анализа поступают в компьютер, который и выдает информацию о физической карте анализируемой ДНК. Ллазмидлые и вируслыеДИК. Картирование обычно начинают с использования рестриктаз, которые расщепляют ДН К на небольшое число Фрагментов.
Порядок рестриктов легко устанавливается из анализа резульзатов олновременного перевара ДНК двумя рестриктазами или ее неполного гилролиза олним Ферментом. Из этих же Ланных лелается вывол о циркулярности или линейности анализируемой молекулы ДН К. При лействии олной рестриктазы на кольцевую ДНК число рестриктов равно числу сайтов ресзрикции, а у линейной молекулы оно на елиницу больше. При действии двух рестриктаз на кольцевую ДНК число рестриктов равно ей ммарному числу рестриктов, найденному для одиночных пере- варов„а у линейной молекулы в этом случае суммарное число ресзриктов на единицу меньше. 290 Чаеть Д.
генная енвненевив !н лая Установим, например, структуру н построим Физические карты для двух препаратов плазмил (рис. 9.7). В варианте "а" прежде всего обращаел! внимание на то, что при двойном переваре сумма ллин Фрагментов меньше, чем при одипочных переяарах (11 вместо 12 т.п.н.). Кроме того, зона, соответству1ощая рестрикту длиной 1 т.п.п., более интенсивно прокрашена.
![](https://s.studizba.com/z.php?f=/templates/si/i/noavatar.png&w=100&h=100&t=1"){kind=avatar}
