Рыбчин - Основы генетической инженерии - 2002 (947310), страница 58
Текст из файла (страница 58)
Положение электрофоретических зон фиксируют на рентгеновской пленке. При секвенировании важно выбрать то |ки отсчета анализируемых нуклеотидов. В химическом методе лля решения этой проблемы в 5'- или 3'-конец анализируемого одношпевого фрагмента ДНКвводят радиоактивную метку. При использовании метода полимеразного копирования отсчет нуклеотидов начинают от праймера, инициирукпцего синтез полинуклеотидной цепи. Оба метода позволяют определить в одном эксперименте последовательности не более чем в 300 нуклеотидов.
Известные методы секвенировапня небезошибочны. Поэтому нри определении новой нуклеотидной последовательности эксперимент следует повторить. Лучше всего это сделать, проанализировав комплсментарную цепь ДИК. В случае выявления мутации в уже известной последовательности повтора не требуется. Лгьипческпй гпегп~д. Метод Максама — 1 илберпа основан на реакциях„которые специфически модифицируют азотистые основания (табл. 9.2). Таблица 9.2 (.",пособм модификации специфических оснований и разрыва цепей ДИК *Используется горячий (90"') 1М пиперилпн.
Зб2 е!асть !!. Геагиая инженерия ги 1але Затем модифицированные основания при последующей обработке отсоелипяются от нуклеотилной цепи, в результате чего цепь рвется пиперилином в сахаре, не содержащем основания (рис. 9.13).
1О)(~А 11 т ы А)(с)1т) Р~ Р Р 1 Р~1,Р Модифиаалиа основании 1о 11 А )! т~~А)(с 1( т) Р' ' ф Удаление основание ~ и ~2 (А ~ ! А 1 1с ) ~ т, Р'' Р ! Р'' Р'1,Р'~ 1: !я !' 1' ~е Разрыв иена ,' а ),' А ) !' А ) ( с1 1кт ) Рис. 9.13. Этапы химических реакций прл секвепиравании ДР!К по методу Максима-Гилберта. !3 кажаой из реакционных пробирок цепи рвутся около !или преимущественно около) определенного нуклеотила, причем реакция идет в условиях, когда в среднем на олпу молекулу приходится один разрь1в. Поэтому каждая пробирка в конце реакции содержит лва набора цепей разной ллины: в одном наборе цепи начинаются с 5'-конца, а в другом — с 3'-конца.
На конечном этапе солержимое всех пробирок подвергают (как это описано па стр. ЗО ! ) электрофорезу в полиакриламилном геле на параллельных дорож- ках, а положение электрофоретических зон фиксируют на рентгеновской пленке. Оба упомянутых набора содержат информацию о положении одноилзенных нуклеотидов, но на авторадиограмме выявляется тот, у которого конец помечен. Поскольку отсчет нуклеотидов начинают от этого конца, положение зон ца элек~рофореграмме можно отождествить с положением нуклеотидов в анализируемом фрагменте !рис.
9. )4). с с с л+ао с+тс в) с'т А-~о а) б) Рис. 9. )4 Анализ нуклеотялной последовательности по Максаму — Гилбсрту: о — анализируемый рестрикт ДН К; б — набор фрагментов при различных условиях модификации ДНК; в — злектрофорсграммы фрагментов, по которым устанавливается последовательность нуклеотидов. А+С, б, С+Т, С вЂ” концевые нуклеотиды при различных условиях модификации ДНК Метка обычно вводится в 5'- или в 3'-конец дуплекса, 5'-конец метится последовательныл1 действием щелочной фосфатазы и полинуклеотиакиназы фага Т4 (см.
гл, б), Мечение 3'-конца практично только при выступающем 5'-конце дуплекса, В этом случае ДНК-полимераза! лосграивает дуплекс, используя меченые !о- оР!е))л)ТР. После введения метки ДНК деньпурируе гся, нити разделяются и секвенируются по отдельности. Меченый дуплекс можно также "разрезать" рестрикгазой, рсстрикты разделизь электро- о ! с А о ! А Глава 9. Лноооз генов о гвнолеов 303 304 Часть 1!. Генная ннжеяерня !и атно а О О -Р— О О НΠ— Р О' Р О- О сн, О Оснавснис .1.- '- 1. 41; н и э з' н н Рис.
9.! 5. Сзроенне лилезокслнуклеозилтрифосфата В реакционной смеси кроме четырех стандартных дезоксипуклеозидтрифосфатов (г!г!ТР) присутствует один из их синтетических аналогов — 2', 3'-лидезоксинуклеозидтрифосфат (гЫХТР, рис. 9.15). ДНК-полимеразы мо! уг включать данный аналог в синтезируемую цепь по правилу комплементарности. Однако из-за того, что у аналога 3'-углерод рибозы вместо гидроксильной группы содер- форезом и секвенировать каждый в двунитевой форме.
Фрагменты ДНК, происходящие из немеченой пити, не проявляются на авторадиограмме и не мешают анализировать резулщ аты. При длине дуплекса менее 500 п.н. можно получить его полную последовательность, начав анализ с обоих концов. Меиюд оояимеразпого Геоиироваиил. Из ряда вариаций метода Сэнгера наиболее практичен способ терминируклцих аналогов нуклеотидов (Вапаег ег о!., 1977). Он сводится к следующему. Анализируемые фрагменты клонируют в векторах, сконструированных на базе нитевидных фагов.
Как правило, лля агой цели используют векторы серии М13щр, рЕМВ(. и В1иезспрк Субсгратом реакции полимеразного копирования служит (+)-нить вектора, к которой рялом с анализируемым фрагментом присоединен стандартный праймер (см. рис. 7.4,о). Синтез ДН К можно вести с помощью кленовского фрагмента ДНК-полимеразы 1, но лу цпе использовать вариагпы ДНК-полимеразы фага Т7 (секвеназы), которые обладают большей процсссивностью, или термостабильную Тас ДНК-полимеразу, позволяющую наращивать цепи при 70"С. В обоих слу аях уменьшается возможность ошибок в терминапии синтеза.
вызванных вторичной структурой анализируемого фрагмента. 1 лава 9. Анониз генов и гено>ноо 305 жит водород, цепь расти дальше не способна. Таким образом, терминация цепи происходит строго на определенном нуклеотиде, заданном экспериментальными условиями. Соотношение коппс>праций <Р~ТР и й1)4ТР подбирается с таким расчетом, чтобы в среднем одна молекула впало> а включилась (естественно, в разных местах) во все расгу>пие цепи. В результате, если в пробирке содержится ооАТР, то к концу реакции в ней оказывается набор всех возможных полинуклеотидов, начинающихся с 5'-концевоп> нуклеотида праймера и заканчивающихся дезоксиавенозином (точнее, его аналогом сЫЛТР). В матричной цепи оп будет указывать на положение тимидина (рис.
9.1б). При остановке реакции часть полинуклеотпдных цепей терминируется нормальным нуклеотидом случайным образом. Чтобы искал>чить ьпу >юмеху, в кон»е реакции в реакционнук> смесь лобавляют избыток всех 4 оМТР. Вследствие этого цепи без >ЫХТР (в нашем примере — без е)с)ЛТР) лосграиваются до конца матрицы и не меп>ают анализу. Реакции ведут параллельно в четырех пробирках, в каждую из которых добавляют один из терминирующих аналогов. Синтезированные полинуклеотиды снима>от с матрицы формамидом и анализируют электрофорезом в полиакриламидном геле в денатурируклцих условиях. Положение электрофоретичсских зон, фиксируемое па авторалиограммах, указывает на последов>>тель- ность нуклеозидмонофосфатных остатков в анализируемом фрагменте ДН К.
Мечение синтезируемых фрагментов достигается либо добавлением в среду какого-либо с(1>(ТР, содержащего фосфор»Р в а-положении, либо введением»Р в 5'-конец праймеров с помощью полинуклеотидкиназы. Число зон, прочитываемых на электрофореграмме, зависит от степени их четкости. В-Излучение фосфора цР достаточно жесткое, что приводит к размытию зон, особенно в начальной части > еля. Кроме того, е>о небольшой период полураспада (!4,3 дня) привносит многие технические неудобства, в частности, не позволяет проводить повторнук> авторадиографию образцов.
По этой причине в последние годы для секвенироввния прелпочитвют использоватьтионуклеозидтрифосфать>, меченные серой»Б (период полураспада 87„4 дня) в и-положении (см. рис. 8.7). 306 ь!асть П. 1еиния инженерия ни г!тгв ! Нч12 ! нею ьн4 ) ( М-1 6) а) в) ния — присоединение к каждому из четырех терминнрую!цих аналогов специфической метки, отличающе!лся от других спектром флуореспенции. Такие модифицированные нуклеозидмонофосфаты включаются в цепь ДНК-полимеразой и выполняют сразу д!зе функции — термипируют синтез ДНК и вводят метку в ее 3'-конец. Все это значительно упростило процедуру секвенпрования: фсрментативную реакцию проводят в одной пробирке и, соответственно, электрофорез продуктов реакции ведут на одной дорожке. Специальный детектор спектра флуоресцепции определяет поочередно прямо в геле природу концевого нуклеотила у разделенных продуктов и передает эту информацию в компьютер, гле эта ин4юрмапия накапливается и обрабатывается (см.
приложение). Перспективен для ли омкгизации метод мультиплексно<.о секвенировапия (Сйпгсй, К!е((ег-Н!88!пв, 1988). В этом варианте для каждой из четырех реакций готовится свой праймер. Праймеры состоят из двух частей по !5 — 20 нуклеотидов каждая. На их 3'-конце находится одинаковая для всех последовательносттч идентичная стандартным праймерам для векторов М!31пр, а 5'-концевая последовательность специфична для каждого праймера.
После реакций секвенирования гель-электрофорез ведут на одной до- 5' с с А т ц т с с А о с т 0 А т Рис. 9.16. Анализ нуклеотилпой последоватвлыюсти по методу терминирующих аналогов пуклеозидтрифосфатов: а — олнонитсвой фрагмент ДНК (матрица) с анализируемой послсловательиостыо; й — слигонуклеагилы, синтезированные на матричной ДНК в присугст вин праймсра (жирная линия), четырех дсзоксинуклеозилтрифосфатов и еЫАТР; в -- злектрофореграмма олигонуклеотидов, синтезированных в присутствии гЫАТР. )ч' — число звеньев в праймсре С введением в практику флуоресцентных меток достигнут серьезный прогресс в автоматизации процесса секвенирования.
Наиболее эффективный способ их использова- Глава 9. Анл»а генов и генол>ов 307 рожке, фрагменты ДН К переносят на гибридизапионный фильтр и результат прочитывают, используя специфические зонды к 5'-концам праймеров. Секвепирование определенного фрагмента ДН К можно проводить и без клонирования в присутствии большого количесгва посторонней ДНК„если доступен праймер для анализируемого фрагментл. К примеру, для секвенирования генов, мугировавших в результате инсерционного мутагенеза (см. гл.
![](https://s.studizba.com/z.php?f=/templates/si/i/noavatar.png&w=100&h=100&t=1"){kind=avatar}
