Рыбчин - Основы генетической инженерии - 2002 (947310), страница 62
Текст из файла (страница 62)
Задержка рибосомы на каком-либо редко используемом колоне из-за нехватки тРНК приводит к включению ошибочной аминокислоты, сдвигу рамки считывания или остановке трансляции. 322 Часть !! !. Зкеиреееия чужервдивих генов Правило оптимальности колонов распространяется и на терминирующие триплеты: в активно экспрессирующихся генах предпочтительно используется кодоц ЦАА.
Возможность влиять на эффективность экспрессии генов путемм в ы б о р а о п т и и а л ь и ы х к о д о и о в вози икает в случае, когла планируется химический синтез гена или его части. Олнако простое слеловапие правилу оптимальности лалеко не всегда ласс желаемый результат, поскольку скорость трансляции мРНК и ее стабильность определяются всем ее эволюционно выработа!щым контекстом. Во-первых, присутствие в мРНК повторов и шпилек должно быть функционально оправдано. Во-вторых, слелует учитывать, что на эффективность трансляции влияют также и окружаюгцие колон нуклеотиды.
Так, у Е со2г лизин предпочтительно кодируется колоном ААА, если за ним следует С, или колоном ААС, если за ним следует С или А. Из двух олносмысловых колонов !ЧХА или !Ч!ЧС, предшествующих колону ААА, чаще встречается !ЧХС. У эукариот крайне редко встречается динуклеотид СС, а у прокариот ограниченно используется линуклеотид ТА.
Подобные ограничения предотвращают, возможно, нежелательные взаимодействия соседних тРНК в рибосоме, приводящие к сдвигу рамки считывания. В кодирующей части прокариотических генов почти не попадаются ЯЭ-последовательности САСС и ССАС, по-вилимому, для того„чтобы избежать внутригенной инициации трансляции. В третьих, замечено, что у генов, копирующих полифункциональные белки, неоптимальные кодоны часто встречьэотся в сцейсерных участках между областями, кодирующими разные домены белка. Задержка трансляции в таких участках, по-вилимому, дает возможность сформироваться необходимой пространственной структуре домена.
Отметим, наконец, в-четвертых, что из сипоцимических кодонов в генах реже встречаются те, которые содержат 100 % С, С, А, Ц, а также СС или АЦ. Цель этого ограничения — подлерживать силу взаимолействия кодон-аптикодон ~а приблизизельно одинаковом для всех кодонов уровне, что позволяет оптимизировать скорость трансляции (Сгоагеап, Г1егз, !982). Из сказанного ясно, что эффект замены синонимических кодонов непредсказуем. Практические рекомендации при пла- Глава 10.
Бактерии 323 нировании синтеза геьса сводятся к следующему: 1) составляется последовательность из оптимальных колонов; 2) с учетом структуры прилегающего участка вектора эта послеловательность модифицируется так, чтобы она соответствовала требуемому консенсусу около инициирующего кодона и одновременно препятствовала образованию шпилек в этой области мРНК; 3) в последовательность вносятся изменения, которые учитъ|вают предпочтительность нуклеотидов, следующих за 3'-концом кодонов (см. табл, 5.1), но не изменяют аминокислотный текст; 4) проводится проверка планируемой мРНК на наличие в кодирующей области потенциальных Я!3-сайтов и вторичных структур и по возможности осуществляется заключительная модификация, устраняющая эти особенности.
Уроаеиь белка. На этом уровне эффективность экспрессии зависит от 1) стабильгюсти полипептида и 2) его внутриклеточной агрегации. В практическом плане важны также 3) возможность правильной модификации чужеродного белка (включая его процессинг) и 4) его способность к секреции.
! . Стабильность полипептидов в клетках зависит от протеаз, играющих важную регуляторную роль. Они осу1пествляют процессинг белков при их секреции, превращают пре-белки в белки, отщепляют )Ч-концевой формилметиониц и т. д. Кроме того они гидролизуют нефункциональные или денатурированные полипептиды, образующиеся в результате нонсенс-мутаций, делеций, неудачной посгсинтетической модификации или процес- синга, полстановки аналогов природных аминокислот нли даже просто других аминокислот. Эта участь постигает и избыточные количества функционально активных субъединиц мультимерных белковых комплексов, а также многие чужеролные белки — пролукты экспрессии клонированных генов, что заставляет отдельно решать проблему стабильности бел кол.
Механизм избирательного протеолиза белков в деталях не выяснен. В Е со)1 появление аберрантных полипептидов вызывает индукцию белков теплового шока, включая АТР-зависимую сериновую протеазу (эндопептидазу) 1 оп, АТФазная активность этой протезеазы индуцируется только в присутствии измененных белков, что свидетельствует о ее способности распознавать 324 Часть 111.
Элолреееил лужероолмх голое их. Каким образом она "'чувствует" конформационные изменения в разнообразных белках, пока неизвестно. Выявив подобные изменения в белках, она расщепляет их ло мелких фрагментов„а дальнейшее расгцепление ведут лругие знло- и зкзопептилазы. Наиболее практичный способ стабилизации чужеродных белков основан на наблюдении, что короткие полипептиды менее стабильны, чем длинные. Чужеролпый белок удлиняют путем его слияния с белком, который кодируется векторным ~сном (см. ниже). Удлинения полипептила можно достичь с помощью олигомсризапии полипептила. Так, четыре гена проинсулипа были соединены олигонуклеотидами, в которгях была закодирована мишень для разрезания олигопроинсулина бромциапом (Ьпеп, 1984).
Проинсулин, полученный после разрезания, был биологически активным. Время его полураспада в клетках Е. сой равно 2 мин, а его тетрамера — 120 мин. Использование в качестве реципиентов клеток с мутациями в генах (ол и лргВ также позволяет увеличивать время жизь ~и чужеродных белков. Например, время полураспала ростового фактора соматомсдина-С в клетках Е. со11 Н В101 равно 2 — 5 мин, а в клетках 1оп Ьргй- оно превышает 60 мин, что одновременно сопровождается повышением внутриклеточной концентрации фактора в четыре раза (Вней ег а/., 1985).
2. В системе й~ у(гголенатурированные белки взаимолействуют друг с другом гилрофобными участками, агрегируют и выпалантг в осадок. По-вилимому„схолный процесс часто происходит и в клетках, когла они синтезируют большие количества аберрантных полипептилов. Такие полипептиды, а также нормальные по амипокислотной последовательности рекомбинаптные белки, могут образовывать нерастворимые агрегаты. В н утриклеточная агрегация белков явлнетсяоднимизспособових сохранения в клетке. Феномен внутриклеточной агрегации рекомбинантных белков сц1е плохо понят: по структуре генно-инженерного белка нельзя прелсказать, как о себя повелет.
Например, более 90 % фактора некроза опухолей человека с высоким уровнем экспрессии (20 % от общего белка) в клетках Е. сой НВ101 нахолится в растворимой форме. В то же время синтезированный с того же вектора и ло того же уровня человеческий лейкоцитар- Глава 10. Бактерии 325 ный а-2г интерферон находится в тех же клетках в виде нерастворимых агрегатов. В этом случае после лизиса клеток лишь около ! % интерферона зкстрагируется в волную фазу, а его основная часть экстрагируется только детергентами (например, додецилсульфатом натрия) или хаотропными веществами, сохраняя при этом свою активность. Непредсказуема и кинетика накопления белков в клетке в процессе их культивирования.
Количество а-2-интерферона в клетках остается постоянным вгцють до перехода их в стационарную фазу роста. Затем содержание интерферона в клетке начинает увеличиваться и через 20 часов превосходит прежний уровень в 30 — 40 раз, в то время как количество В-лакзимазы, кодируемой тем же веюором, не изменяется (рис.
10.1; Рапауо1азоа ег а1., 1983). оп 590 гвв э в з.в ч х ьв - ф й иа аа -~$ $, чх вл го зо время„ч ао 1о Рис. 1О.1. Кинетика сингеза а-2 интерферона и (3-лактамазы в клетках НВ101. Культуры азрировались при 37 "С в Е-среде. ° — шпическая плотность (ОП) культуры; Π— активность интерферопа; сл. — активность 0-лактамазы 326 е1асть Ш.
Зктреееал чужеродных генов Для практических целей явление внутриклеточной агрегации рекомбинантных белков носит двойственный характер. С одной стороны, оно полезно, ибо позволяет селективно отделять их от растворимых белков. С лругой стороны, по пи каждый из таких агрегатов требуег разработки индивидуального метола растворения (подбора солюбилизируюшего агента, условий ренатурации и т.л.). Такие методы обычно являются дорогостоящими.
![](https://s.studizba.com/z.php?f=/templates/si/i/noavatar.png&w=100&h=100&t=1"){kind=avatar}
