Рыбчин - Основы генетической инженерии - 2002 (947310), страница 60
Текст из файла (страница 60)
Но самая ьрандиозная задача — программа "Геном чсловска", которая была начата в 1987 году в США и к которой вскоре присоединились мноьис страны, в том числе СССР (Россия). Цель программы — ссквснировать все 24 чсловсческие хромосомы, 22 аугосомы и 2 половые — Х и У. Гаплоидный набор хромосоч содержит около Зх!0'п.н, в нсм имеется приблизитсльно 60 — 80 тысяч генов.
К концу 1998 года ссквснировано 211 млн.п.н., т. с. около 7 % всеь о гснома, картировано 30 тысяч гонов (Г)с)ои)саз ег а)., 1998). Болсс половины данных по ссквснированию представлены контигами разчсром более ) 00 т.п.н. Здссь контигом является клонированный и ссквснированный фраь мент ДНК.
Важной этапной задачей прсвраммы явльшось посгроспис физпчсской карты каждой хромосомы, т. с. последовательного расположения на ной клонированных фрагмснгов (сч. с. 293) Клоны с такими фрагмснтами служат основным материалом лля дальнейших опсраций по ссквсььированикь и для процсдур вылслсния каких-либо конкретных гснов. С учстом среднею разльсра клонированн их фрагмсптов было необходимо установить марксры чсрсз каждыс 100 т.п.н, на вссх хромосомах (вссго около 30 тысяч маркеров).
Теперь чсловсчсскис хромосомы физичсски картированы. Пслу ьсны РАС-, ВАС- и ьгАС-библиотски гснома, в которых суммарный размср вставок составляст десятки эквивалснтов гап;юидных гсномов. Закончить полное ссквснированис генома человека намсчсно в 2003 году, причсм 90 % генома будст проанализировано в 2001 соду. Эти планы опираются на стрсмитсльный прогресс в тсхникс и стоимости ссквснирования.
Если в 1990 г. эта стоимосгь составляла $10 за один нуклсотидный остаток, то в 1998 г. она равнялась ужо $0,5. Гель-элсктрофорсз стаьювится возможным проводить в капиллярах, что ускоряет и новышаст точность анализа. Развиваются и "нсьвлевыс" методы — масс-спскзромстрия и гибридизация на кремнисвых "ДНК-чипах", на поверхности которых нанесены десятки тысяч коротких дстсрмин ированных фрагментов ДН К. Важной составляющсй программы "'Геном чсловска" являстся сравнительная гсномика, т. с. сравнение различных геномов. Кромс законченного анализа ДНК нсматоды с этой цсльк> ссквсниру- 312 Часть П. Птишя инженерия ги Мпп к>тся и другие модельные геномы. У АгпЬгг?орли гйа?гала секвенироьано 8,8 из 100 млн.н.н., у СаеппгйпЬгДгД Ьгщаае — 6,1 из 3,000 млн.п.н., у 2)ггхгорЬДа гпе1апо8аггег — ! 6,9 из 165 млн.п.н., у Кс11!гозассйаготусеарогпЬе — 5,7 из 14 млшпдь Анализ генолга дрозофилы будет завершен в 2002 году, генолла мыши — !з 2008 году.
Секвенированис генома человека, без сомнения, будет способствовать прогрессу в выявлении дефектных ! снов и внедрению новых методов диа!мостики и лечения генетических заболеваний. Станет возможным выявлять индивидуальные предрасположения к различным заболеваниям и давать рекомендации как их избежать. ВОПРОСЫ ДЛЯ ПОВТОРЕНИЯ И ОВСУ)КДИ!ИЯ 9.1.
При синтезе второй пити кДНК методом ник-трансляции (сьь рис. 9.3,а) не заменяются несколько нуклеотидов иа 5'-конце л~РНК. Почему? 9.2. Число зон, прочитываемых па электрофореграмме, зависит от степени их четкости. !3-Излучение фосфора 'зР лосгато пю жесткое, что приводит к размытию зоп, особенно в начальной части геля. Почему' ? 9.3. Чем определяется выбор вектора дтя получения г еномного банка? 9А.
Составьте план эксперимента по получению банка ~снов дрожжей в векторе рЛд! ОзасВ!1. 9.5. Сосчавгпе ш~ан эксперимента по получению банка кДНК мыши. Какой вектор вы прелпо пете и почему? 9.6. У вас имеется человеческий белок с интересными свойствами. Как найти ген, кодирующий этот белок? 9.7. Скринипг банка генов человека позволил вам о~ыскать ген в задаче 9.6.
Как определить, на какой хромосоме он находится? 9.8. Составьте план эксперимента по физическому картированию искомого гена, если известно, иа какой хромосоме он находится. 9.9. Б банке генов, полученном с помощью вектора 7,7АР, найден нужный ген. Составьте план эксперимента по его секвенированию. 9.10.
Опишите, из каких этапов складывается работа но секвенированию клеточных геномов. ЧАСТЬ И! ЭКСПРЕССИЯ ЧУЖЕРОДНЫХ ГЕНОВ Решение проблемы клонирования чужеродных генов позволило детально изучать их структуру. Для исследования жс строения и функпий копируемых ими белков, а также для использования этих белков в прикладных целях необходимо добиваться экспрессии чужеродных генов. В настоящее время трудно представить„как можно было бы изучать молекулярнукз биологию высших эукариот без методов генетической инженерии, особенно не имея возможности вмешиваться в экспрессию определенных генов в определенных кчстках и тканях организма.
Замена функционального аллсля гспа на полностью дефектный (нуль-аллель) и наблюдение фенотипичсского эффекта — самый прямой путь устаноачения его функции. Бьии выяснены принципы, на которых основана тканеспсцифичность экспрессии генов, в общих чертах стали ясны молекулярные механизмы развития индивидуальных особей. Синтез белковых продуктов является одной из важнейших целей генетической инженерии. Производство ферментов, мембранных белков, рецепторов, нейропептидов для использования их в разных целях, включая лечебные, а также структурных вирусных белков как вакцинируюших средств— все это зависит от доступности эффективных экспрсссионных векторов.
Важно иметь широкий выбор экспрсссирующих систем, поскольку каждой из них присущи свои преимушества и недостатки. Выбор системы зависит от природы и количества получаемого продукта, а также от его желаемых свойств (биологическая активность, растворимость, секрстируелюсть, неаллергенность и т. и.).
314 Часть 111. Зксядессвв чужеродных гелвв Как известно, экспрессия генов осуществляется путем их транскрипции и трансляции. Эффективность транскрипции зависит, прежде все~о, от степени сродства РНК-полимсразы к промотору, а эффективность трансляции — от стабильности мРНК и сс способности связываться с рибосомами. Следовательно, системы транскрипции и трансляции рсциписнтных клеток должны "узнавать" последовательности нуклеотидов в регуляторных сайтах клонируемых генов.
Это достигается путем присоединения чужеродного гена к промотору, сайту связывания рибосом и терминатору транскрипции, спспифичным для тех клеток„в которых ген клонируется. Готовый набор этих элементов называют экспрессионной кассетой. Встраивание в кассету чужеродного гена приводит обычно к его экспрессии. Однако не всегда при успешной экспрессии чужеродного гена можно получить функционально активный продукт. Дело в том, что многие эукариотичсские белки активируются только после их молификации 1напримср„после протсолиза, гликозилирования, фосфорилирования и т.
п.), происходягцей в результате действия специфических клеточных ферментов. Но чужеродные белки могут неправильно модифицироваться или не модифицироваться вообще. Это ограничивает выбор рециписнтных клеток, когда нужно получить активные модифицированные белки. В таких случаях для клонирования генов приходится использовать клетки организмов, родственных тем, откуда были взяты гены. С этой целью разрабатываются системы клонирования и экспрессии генов в различных семействах бактерий и низших грибов, в растительных и животных клетках (в'Гранскрипция и трансляция. Методы"', 1987; "Махппиптя яспе ехргеаа)оп", 198б).
Глава 10 БАКТЕРИИ Проблемы, возиикающис при экспрессии чужеродных генов в бактериях, наиболес полно исследованы на клетках Е. са1б В них переносили гены из клеток, родственных с ними в различной степени. Как оказалось, при вцутрисемействснном переносе генов их экспрессия осуществляется сравнительно легко, поскольку в данном случае нет разницы между системами транскрипции и трансляции донорных и рсципиеьпных клеток. Однако уже при межссмейственном переносе из-за более существенной разницы между этими системами чужеродпые гены экспрессируются неэффективно.
Системы транскрипции и трансляции про- и эукариот отличаются принципиальпо (см. табл. 1.1). В связи с этим экспрессия эукариотических генов, перенесенных в бактерии вместе с собствсиными регуляторными элементами, происходит лишь из-за случайных благоприятных совпадений. Иоэтому необходимо заменять эукариотические регуляторцыс элементы па бактсриальные, для чего было предложено несколько способов.
С их примецеиием была в основном решена проблема экспрессии чужеродных генон в бактериях. К цастоящсму времени >е сложилось четкого представления о механизмах влияния локальной структуры ДНК на эффективность транскрипции генов. Не выяснены до конца также причи ны нестабильности векторов и рскДНК в репипиентцых клетках. Нестабилен в бактериях и сам чужеродный белок.
Кроме того, установлено, что состав колонов эукариотичсских генов не оптимален для их экспрессии в бактсриальных клетках. В связи с этим приходится принимать ысры по оптимизации экспрессии чужеродных генов, т. е. подбирать подходящие промоторы, операторы, терминаторы транскрипции, сайты связывания рибосом, фи- 3 ! 6 Часть !И. Зкслрсссих Ь!схсеродлмх гелое зиологическис условия и т. л. Ула шо налаже!шая система экспрессии приводит к образованию супсрпролуцснтов, в которых выход чужсролного цролукта может достигать 10 — 40% от суммарного белка.
Важнейшие задачи при культивировании суперпролуцентов — подлержание их стабильности и обеспечение секреции синтезируемых ими продуктов. Проблемы экспрессии чужДНК в бактериальных клетках Экспрессия генов явл5!стоя сложным многозтапцым процессом, завис5!гцим от мно!'их !1>авторов, котор!яе влияют на 3!от процесс на разных уровнях — на уровне ДНК, мРНК или белка. Зровепь ДОК. На этом уровне эффективность экспрессии зависит: 1) от силь! промотора; 2) наличия терминатора транскрипции; 3) отсутствия внутри!енных герминаторов транскрипции; 4) числа копий гена; 5) супсрспирализапии рскДНК; 6) от расположения чужеродного гена по холу движения репликативной вилки. Рассмотрим по очереди зти факторы.
1. Силу промоторов определяют по тому, с какой частотой они способны инициировать акты транскрипции. У сильнейших промоторов (например, в генах рРНК) зто происходит кажлые 5 — 10 с, у слабейн!их (например, промотор гена 1ас!)— олин раз за генерацию. Промотор относят к сильным, сели контролируемый им ген обеспечивает синтез белка, составлявший не менее 10% от суммарного белка. Сила промотора зависит от двух параметров — константы связывания РН К-поличеразы с промотором (этот процесс приводит к образованию закрытого комплекса) и от скорости раскрытия этого комплекса, т.
с. скорости разрыва в нем водородных связей между комплементарными нитями ДНК (МсС!нге е! а!., !983). Чем выше эти параметры, тем промотор сильнее. У сильных промоторов структура боксов — 10 и — 35 оказалась слегка отличной от сгандартной. Бокс — 10 прелставлсн послеловательносгями РнТАТАТРн или ТАТАМ'Ры, а бокс — 35— послеловатсльностями ((3/С)ТТ(С/С)А(О/С)А(А/Т)ТТ(С/Т) или ТТ(С/С)ТТОАСА(А/С), причем перел этим боксом обычно нахольггся ЛТ-богатый участок (Артемьев и др., 1983). Эффективность транскрипции повышается также, если в зоне основного промо- Глава ! О. Бактерия 317 тора имеются дополнительные сайты связывания РНК-полимеразы. Подобные множественные промоторы имеются, например, у 1ас-оперона (Кехи!!го1Т ег а1.„1985).
![](https://s.studizba.com/z.php?f=/templates/si/i/noavatar.png&w=100&h=100&t=1"){kind=avatar}
